學位論文
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Item 基因剃除血栓烷A2合成酶和血栓烷前列腺素接受器訊息對腎缺血再灌流引起之氧化傷害效益(2020) 覺宗宏; Chueh, Tsung-Hung我的研究目的是利用剔除「血栓烷A2合成酶/血栓烷A2/血栓烷前列腺素受體」(TXAS / TXA2 / TP)的基因，來阻斷它的信號傳導，檢驗是否可以減少小鼠的腎臟缺血/再灌注的損傷。「血栓烷A2合成酶/血栓烷A2/血栓烷前列腺素受體」(TXAS / TXA2 / TP)的正常生理功能，可促進血管收縮，以及血小板凝集，幫助人體在受傷時止血。但在許多病理情況下，會造成「血栓烷A2合成酶/血栓烷A2/血栓烷前列腺素受體」(TXAS / TXA2 / TP)過度活化，誘發氧化傷害，例如，心肌梗塞，肺高壓，子癲前症，器官移植，狼瘡腎炎，敗血性休克，腎絲球腎炎，以及各類血栓疾病。在以上的病理情況下，血栓烷A2合成酶（TXAS）活性會增強，刺激血栓烷A2（TXA2）釋放和血栓烷前列腺素受體（TP）活化，造成嚴重的血管收縮和氧化損傷。因此，本研究利用基因剔除「血栓烷A2合成酶/血栓烷A2/血栓烷前列腺素受體」(TXAS / TXA2 / TP)的訊號傳遞，期待瞭解更多關於腎臟缺血/再灌注損傷的病理機轉，並希望能在這樣的基礎上研究出治療方法。中醫藥有數千年的傳承，其中，活血化瘀藥的使用，在中醫治療腎臟病中，扮演重要的角色，但其中的現代藥理機轉，仍有待進一步研究。活血化瘀的效果，類似現代生理的血管擴張與抗凝血作用，與TXA2的效果相反。因此，本研究希望這次的實驗結果，可以在未來作為研究中醫活血化瘀藥物治療腎臟病的研究模型，以期揭開中醫神秘的面紗，並找出中醫藥在現代疾病的應用。 本研究分別在以下四種基因型小鼠TXAS+/+TP+/+，TXAS–/–,TP–/–以及TXAS–/–TP–/–身上，評估了靜脈注射U46619（TXA2模擬物）和45分鐘腎缺血再灌注（I/R）所造成的的腎臟血流動力學變化和腎損傷。我檢驗了腎臟中TXAS和TP的基因表達狀況，血尿素氮（BUN）和肌酐酸，活性氧（ROS）的量，還有促炎性細胞因子和細胞死亡的病理生理機轉，包括I/R損傷下造成的的細胞凋亡，細胞自噬和細胞焦亡。 實驗結果發現，在野生型的小鼠(TXAS+/+TP+/+)身上，腎臟的缺血/再灌流(I/R)，增強了TXAS，TP的表現；也增強了發炎及氧化壓力相關的參數，包括細胞核中NF-κB，NADPH氧化酶gp91的表現；三種計畫性細胞死亡的參數，也有顯著增加，包括細胞凋亡(Bax / Bcl-2 / Caspase-3)，細胞自噬(Beclin-1 / LC3 II)，細胞焦亡Caspase-1 / gasdermin D / IL-1β)。而且，野生型小鼠中腎臟TXB2濃度，ROS含量，血中尿素氮，肌酐酸，在經過缺血/再灌流(I/R)之後，都有顯著上升。而能夠 擴張血管的eNOS在腎臟中的表達下降。 在另外三種基因剔除小鼠中(TXAS–/–,TP–/–以及TXAS–/–TP–/–)，所有的增強參數均顯著降低。在TXAS+/+TP+/+和TXAS–/–小鼠中，靜脈注射U46619顯著抑制了腎微循環並增強了gp91和Bax / Bcl-2；在TP–/–和TXAS–/–TP–/–，靜脈注射U46619，則沒有這種效果。腎臟的缺血再灌流，顯著降低了四組小鼠的腎臟微循環，但是跟野生型小鼠(TXAS+/+TP+/+)相比，TXAS–/–, TP–/– 和TXAS–/–TP–/–這三組小鼠，恢復至基準線腎血流量的時間顯著縮短。由以上可知，阻斷(TXAS / TXA2 / TP)信號傳導，可減弱I/R造成的促炎細胞因子增加。 由本研究的結果可知，透過基因剔除來阻斷TXAS / TXA2 / TP信號傳導，可透過抗氧化，抗發炎，抗凋亡，抗自噬和抗焦亡的作用，對於缺血/再灌流造成的腎損傷產生保護作用。TXAS / TXA2 / TP信號傳遞路徑，主要的正常生理作用為促進血小板凝結，跟促進血管收縮。中醫的活血化瘀藥，常用於治療腎臟病。而這些活血化瘀中藥的效果，類似現代藥理作用中，促進血流增加與抗凝血的作用，與TXA2的作用相反。因此，在未來，我們可以利用本研究的動物模型來測試，中醫活血化瘀藥物治療腎臟病的機轉，是否與抑制TXAS / TXA2 / TP信號傳遞路徑有關。Item 天然植化素槲皮素與蘿蔔硫素對糖尿病大鼠的泌尿系統保護機轉(2020) 林嘉發; Lin, Chia-Fa本論文主要在探討天然植化素（phytochemicals）對於糖尿病大鼠的泌尿系統保護作用，並研究有關細胞凋亡（apoptosis）、細胞自噬（autophagy）、發炎性細胞凋亡（pyroptosis），和粒線體功能的作用機轉。我們建立了兩種不同誘發糖尿病的動物模型，第II型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM）模型，與第I型糖尿病（Type I diabetes mellitus, T1DM）模型。T2DM模型主要研究對象是第II型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM）之腎臟細胞損傷與保護，而T1DM模型則是用於研究糖尿病的排尿功能障礙，這通常會發生在較嚴重的T1DM高血糖狀態，因為T1DM模型可以快速誘導糖尿病膀胱（diabetic bladder）損傷。 我們萃取富含槲皮素（quercetin）的番石榴汁，並混合不同比例的海藻糖（trehalose），來研究其對於T2DM大鼠腎臟和胰臟損傷的保護作用，並採用高效液相色譜分析法以測定番石榴汁的有效成分。通過腹腔注射菸鹼醯胺（nicotinamide）和鏈脲佐菌素（streptozocin），結合高果糖飲食誘導Wistar大鼠T2DM模型，持續8周。用不同劑量的番石榴汁混和海藻糖餵養大鼠4周，檢測口服葡萄糖耐量試驗（Oral Glucose Tolerance Test, OGTT）、血漿胰島素（insulin）、糖化血色素（glycated hemoglobin, HbA1c）、胰島素抗性指數（Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance index, HOMA-IR）、β細胞功能和胰島素分泌指數（Homeostasis Model Assessment of β-cell function, HOMA-β）。我們也使用了免疫組織化學染色法、螢光染色法和西方墨點法來測定氧化和發炎程度，用化學發光分析儀測定了血清和腎組織活性氧類（Reactive Oxygen Species, ROS）濃度。 結果發現，番石榴汁中高含量的槲皮素對過氧化氫（Hydrogen Peroxide, H2O2）和次氯酸（hypochlorous acid, HOCl）有清除作用，而海藻糖對H2O2有選擇性清除作用，而對HOCl無清除作用。對於T2DM的OGTT、insulin、HbA1c、HOMA-IR和HOMA-β水平均有影響，而番石榴混和海藻糖對T2DM改變的參數，除HbA1c外均有顯著改善。番石榴汁混和海藻糖能顯著降低T2DM所增強的腎臟ROS、4-hydroxynonenal、caspase-3/apoptosis、LC3-B/autophagy，以及 IL-1β/pyroptosis的水平。研究結果顯示：番石榴汁混和海藻糖的攝取，對於因T2DM而損傷的胰臟和腎臟細胞，具有顯著的保護作用。 嚴重的高血糖能誘發氧化壓力，造成糖尿病膀胱（diabetic bladder）,進而引發排尿功能障礙。我們在論文中探討了蘿蔔硫素（sulforaphane），一種具有抗氧化力的轉錄因子Nuclear factor erythroid 2-related factor 2（Nrf2）激活劑，是否具有預防糖尿病因高血糖而併發膀胱功能障礙的功用。糖尿病誘導前給予鏈脲佐菌素和蘿蔔硫素，用化學發光分析儀測定膀胱活性氧類，另用西方墨點法檢測粒線體功能、粒線體Bcl-2-associated X protein（Bax）和胞漿細胞色素cytochrome c、抗氧化防禦能力Nuclear factor erythroid 2-related factor 2／heme oxygenase-1（Nrf2/HO-1）、內質網壓力標誌物Activating transcription factor 6／C/EBP Homologous Protein（ATF-6/CHOP）和Caspase 3／poly ADP-ribose polymerase （Caspase 3/PARP）。糖尿病增加膀胱組織中Keap1的表現，並降低Nrf2的表現，與膀胱活性氧增加、粒線體Bax轉位、胞漿細胞色素（cytochrome c）釋放、ATF-6/CHOP、Caspase 3/PARP/apoptosis增加有關，通過增加排尿間隔時間和排尿時間導致排尿功能障礙。蘿蔔硫素能顯著活化Nrf2/HO-1軸的表現，減少膀胱活性氧、粒線體Bax轉位、細胞色素C釋放、ATF-6/CHOP和caspase 3/PARP/apoptosis，從而通過縮短排尿間期和排尿時間來改善排尿功能。根據研究結果，我們認為蘿蔔硫素通過激活Nrf2/HO-1信號通路保護了粒線體功能，並抑制糖尿病誘導的ROS、內質網壓力、細胞凋亡和排尿功能障礙。 研究顯示，天然植化素槲皮素與蘿蔔硫素，的確具有保護糖尿病大鼠泌尿系統之效益。