學位論文
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Item 探討新生期地塞米松投藥處理對於海馬迴內 BDNF-mTOR 訊息傳遞路徑的長期不良影響(2023) 吳宗訓; Wu, Zong-Syun重鬱症 (major depression disorder) 為高盛行率的精神疾病，抗抑鬱藥 (antidepressants) 雖已被廣泛使用於控制及防止重鬱症的惡化，但此類藥物仍存在諸如：從開始服藥至症狀改善之間耗時甚鉅或強烈不良副作用等缺點，因此現存抗抑鬱藥於臨床應用上對於實際改善病患症狀的效果仍十分有限。綜合上述，故現今對於開發新型抗抑鬱藥物的需求是刻不容緩。目前已知早期壓力曝露 (early life stress exposure) 與不良創傷經驗 (adverse traumatic experience) 均為誘發重鬱症的重要風險因子，本研究使用新生期地塞米松投藥處理 (neonatal dexamethasone treatment, NDT) 來模擬早年壓力曝露並成功於小鼠中建立類憂鬱行為模式，並以此模式來探討腦源性神經滋養因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR) 訊息傳遞路徑與神經發炎反應 (neuroinflammation)、神經可塑性異常 (abnormality on the neuroplasticity) 等如何參與調控NDT所誘發之不良影響。海馬迴 (hippocampus) 為對壓力曝露十分敏感的腦區之一，並與重鬱症的發病機轉高度相關，本研究將著重於探討NDT對於背側海馬迴 (dorsal hippocampus) 內BDNF-mTOR訊息傳遞路徑所造成之影響。於此研究中，實驗動物將於出生後之初三日，逐日接受遞減劑量 (0.5、0.3、0.1 mg/kg) 之地塞米松 (dexamethasone) 皮下注射，並持續飼養直至六週齡時犧牲，並以即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR) 分析相關訊息傳遞分子與目標基因的表現量變異，再以胞外電生理技術 (extracellular recording) 紀錄神經訊號傳遞情形。實驗結果顯示，經NDT處理後實驗動物產生長期之不良影響。首先，NDT組之老鼠體重自出生後7至42日與SAL組相比均明顯較輕。NDT組背側海馬迴內之BDNF、TrkB基因表現量下降，顯示其BDNF訊息傳遞路徑受到影響。胞外電生理紀錄發現，NDT組老鼠其海馬迴突觸前、突觸後傳遞與長期增益效應均顯著劣於SAL組動物，上述結果顯示NDT處理將導致動物海馬迴之神經可塑性異常。此外，Nr3C1與Sgk1的表現量上升與Fkbp5的表現量下降顯示其HPA反應軸失調。ELISA結果顯示NDT組之動物血清內相較SAL組具有較高之糖皮質素表現量，然而此差異並未達統計檢定顯著水準。隨後，經檢驗背側海馬迴組織內相關突觸上離子通道表現量，其結果顯示：於NDT組別中Grin2a、Grin2b、Gria1、Cacna1c與Cacna1e表現量下降；然而，Slc1a6、Slc12a5、Gabra3、Gabra4、Gabbr1及Gabrd表現量顯著上升。近一步檢驗突觸蛋白 (synaptic protein) 與細胞骨架相關基因顯示Syn1、Syn2、Arc、Dlg4、Sptbn2與Khdrbs表現量顯著下降。為近一步了解上述變異之上下游訊息傳遞路徑，實驗結果顯示Raptor、Rictor與Ctnnb1基因表現量於NDT 組中顯著下降。除此之外，於NDT組中轉錄因子Nfkb1 基因表現量顯著增加，而Creb1基因表現量顯著下降，但發炎因子Il6與模式識別受體 (pattern recognition receptor, PRR) Nlrp6卻於NDT組中顯著下降。最後，經由連續兩天給予MHY1485，NDT組於懸尾試驗中之不動時間百分比顯著下降，於開放空間試驗中並未發現明顯之行為異常，雖於投藥過程中動物之體重產生些微下降，惟其可於投藥完成後兩天內回覆至基礎水平。綜合上述，實驗結果顯示mTOR訊息傳遞路徑於NDT所誘發之長期不良影響中扮演關鍵角色。據我等所能了解，本實驗為首次利用MHY1485作為抗憂鬱藥進行壓力所誘發之動物類憂鬱行為進行治療，其優良之抗憂鬱效果可作為未來開發新穎抗抑鬱藥物之參考。Item 以小鼠模式探討新生期地塞米松投藥處理的跨代不良影響(2023) 吳奕昉; Wu, Ying-Fang地塞米松(dexamethasone, DEX)為一種人工合成的醣皮質素(synthetic glucocorticoid)，一直以來廣泛當作抗發炎藥物使用，同時也用於治療體重過低的早產兒肺部發育不良導致的發炎。然而，許多研究指出新生期地塞米松治療(neonatal dexamethasone treatment, NDT)可能對新生兒的發育與情緒產長期不良影響。腦源性神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)，是神經系統中重要蛋白質，對於腦部的發育(development)、神經細胞的分化(differentiation)、及神經細胞的可塑性(plasticity)都扮演至關重要的角色，同時，憂鬱症患者腦中，BDNF的表現量會顯著低於普通人，因此本研究將BDNF與其專一受體TrkB作為憂鬱的生物標記(biomarker)來檢測NDT誘發的類憂鬱行為(depression-like behavior)。本研究採用C57BL / 6J品系小鼠，在出生後第一~三日(postnatal day1~3, PND1~3)給予遞減式劑量 (tapering dosage)地塞米松皮下注射，第一、第二與第三日注射的劑量分別為0.5、0.3與0.1mg/kg。在六周齡時，利用開放空間試驗(open field test, OFT)與高架十字迷宮試驗(elevated plus maze, EPM)來評測小鼠的類焦慮行為(anxiety-like behavior)，另外OFT也可用於測量小鼠的自發性運動功能(spontaneous activity)。此外，也於平行組(parallel group)以懸尾試驗(tail suspension test, TST)與糖水偏好試驗(sucrose preference test, SPT)測試小鼠的類憂鬱行為。於相同周齡時進行即時聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction, qPCR)測量海馬迴中的Bdnf、TRKB與β-actin等基因表現，並利用西點墨法(western blotting, WB)評估BDNF、TrKB與β-actin的蛋白質表現量。並在十一周齡後配對產生子代(F2 SxS 與 F2 DxD)。並測量生育隻數(litter size)、存活率與性別比來測試NDT是否導致生殖毒性。此外，也在F2六周齡時以TST與SPT測試是否出現跨代類憂鬱行為。於同周齡時，以qPCR測量海馬迴中的Bdnf、TRKB等基因表現，並以WB測量BDNF、TrKB的蛋白質表現量。最後，以TST評估交叉撫育(cross-fostering)是否影響跨代類憂鬱行為。實驗結果表明，F1 NDT小鼠成長至青春期時體重顯著降低，代表有效投藥。OFT結果顯示 NDT小鼠自發運動功能未受影響，NDT雄性小鼠在中間區域時間(center area)顯著增加，顯示NDT會減少雄性小鼠的類焦慮行為，對母鼠則沒有影響。EPM結果則顯示NDT不會對公母鼠的類焦慮行為產生影響。TST結果顯示F1 NDT與F2 DxD公鼠的不掙扎時間皆增加，在母鼠方面則沒有差異。另外，在SPT中，F1 NDT與F2 DxD公鼠對於糖水的偏好程度也顯著下降，在母鼠方面則沒有差異。上述結果顯示NDT會導致跨代類憂鬱行為的增加。qPCR與西點墨法結果顯示在F1 NDT雄性小鼠海馬迴中BDNF與TrkB表現量都減少，雌性則未出現顯著差異；F2 DxD雄性小鼠在海馬迴中TrkB表現量顯著減少，雌鼠則無顯著差異。以上結果表明NDT會導致海馬迴中BDNF與TrkB表現量的減少，以及跨代TrkB表現量的減少。NDT在生殖方面的影響，包括F2 DxD的生育隻數與存活率都顯著減少，代表NDT會對子代的生殖造成影響，F2在性別比則沒有影響。最後，在TST中經過交叉撫育(cross parenting)的F2 SxS-Df小鼠相對於控制組(F2 SxS)，不掙扎時間顯著增加；經過交叉撫育的F2 DxD-Sf小鼠相對於控制組(F2 DxD)， 不掙扎時間則未出現顯著差異。綜上所述，我們推論NDT誘發的跨代憂鬱可能與NDT造成海馬迴中TrkB表現量有密切聯繫，並且母鼠的照料與遺傳因素皆可能參與NDT造成的跨代憂鬱。Item 探討新生期dexamethasone處理對大鼠海馬迴中動情素受體之表現量及長期增益效應之影響(2021) 仉鵬愷; Chang, Peng-Kai地塞米松（dexamethasone, DEX）是一種人工合成的糖皮質固醇（synthetic glucocorticoids），數十年來被廣泛用作抗發炎藥物 （anti-inflammatory drugs）。同時也用來治療及預防出生體重過低 （extreme low birth weight, ELBW）早產兒的慢性肺部疾病 （chronic respiratory disease）。許多研究指出，新生兒時期的地塞米松治療 （neonatal dexamethasone treatment, NDT）可能對早產兒的情緒 （emotional）和認知 （cognitive）功能產生長期不良的作用。我們先前的研究指出NDT於雄鼠與雌鼠身上，均會造成長期的不良影響，包含類憂鬱行為（depression-like behavior）的增加，以及雌性大鼠海馬迴 （hippocampus）中α型雌激素受體 （estrogen receptor alpha, ERα）和G蛋白雌激素受體 （G-protein coupled estrogen receptor, GPER so-called GPR30）的表現量下降，且可能為NDT對雌鼠造成長期不良影響的重要原因。我們本研究中驗證是哪一種雌激素受體，為造成NDT青少年雌鼠長期不良反應的主因。本實驗中使用新生的Wistar大鼠，從出生後第一天到第三天 （postnatal day 1~3, PND 1-3），給予劑量遞減式 （tapering）的DEX皮下注射，自PND 1-3其劑量依序為0.5、0.3和0.1 mg/kg。 於六周齡時，利用開放空間試驗（open field test, OFT）評估NDT大鼠自發性運動功能（spontaneous activity），另外透過強迫游泳試驗 （forced swimming test, FST），評測NDT大鼠的類憂鬱行為。 此外，準備平行組（parallel group）的NDT大鼠，於相同周齡時進行即時聚合酶鏈鎖反應 （real-time polymerase chain reaction, qPCR）評估海馬迴中Erα, Erβ, Gper, Grin1, Grin2a, Grin2b等基因表現。並利用西方墨點法（western blotting）評估mitogen activated protein kinase （MAPK） 的蛋白質表現量及其磷酸化水平（phosphorylation level）。 亦進行了離體胞外電生理記錄 （in vitro extracellular recording），測量海馬迴以高頻刺激誘導的長期增益作用（high frequency stimulation-induced long-term potentiation, HFS-LTP），以評估其海馬迴的神經可塑性（neuroplasticity）。最後利用強迫游泳試驗，以評估投予ERα致效劑（agonist），是否對NDT大鼠具有抗憂鬱（anti-depressant）的功能。實驗結果顯示，NDT動物青春期前的體重顯著降低，這證明DEX的有效投藥。 OFT的結果顯示NDT動物的自發運動功能未受影響。FST的結果顯示NDT會導致類憂鬱行為的增加。雌性青少年大鼠NDT組的不掙扎的時間（immobility）與對照組相比有顯著增加。而雄性青少年NDT大鼠，則必須先給予高台曝露（platform exposure）之急性壓力處理後，其不掙扎的時間才有顯著增加。qPCR結果顯示，雌性青少年NDT大鼠海馬迴中Erα的表現顯著降低，而Erβ 和 Gper表現量則無明顯差異。NDT雄性青少年大鼠海馬迴中Erα, Erβ 及 Gper的表現量，與控制組間相較，皆無呈現顯著差異。雌性青少年NDT大鼠海馬迴中Grin1, Grin2a 及 Grin2b表現量皆沒有呈現差異。電生理實驗結果顯示NDT母鼠的海馬迴HFS-LTP有顯著下降的現象，而輸入和輸出曲線比值（input/output curve ratio, I/O curve）結果顯示，NDT老鼠與對照組相比有顯著下降的現象。而在配對脈衝促進 (pair-pulse facilitation, PPF) 實驗結果中並無呈現顯著差異。透過表面灌流 (suprafusion) ERα致效劑丙吡唑三醇 （propyl pyrazole triol, PPT）後，NDT雌性大鼠的海馬迴HFS-LTP恢復至正常範圍。而預先投予ERα的拮抗劑methyl-piperidino-pyrazole （MPP），可以阻擋PPT對HFS-LTP的恢復效果；而NDT組經皮下注射PPT後，其不掙扎的時間明顯減少，與對照組相比無顯著差異，顯示其具有降低類憂鬱行為的效果。最後我們利用GPER的致效劑同時為ERα和ERβ的抑制劑氟維司群（fulvestrant）進行驗證，投予fulvestrant無法使NDT雌性大鼠的海馬迴HFS-LTP恢復至正常範圍。 西方墨點法結果顯示，NDT並未影響雌性青少年大鼠海馬迴中MAPK 的蛋白質表現量及磷酸化水平。綜合上述實驗結果，我們推論NDT青少年雌性大鼠的不良反應，較可能是藉由影響ERα的表現而造成。實驗結果可供後續臨床研究參考，例如投予PPT治療NDT所造成的長期不良反應。