學位論文
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Item TBP 的功能缺失參與在Tauopathy 的致病機轉中(2012) 王湘瑜; Hsiang-Yu Wang前人的研究發現阿茲海默症患者腦中TATA box binding protein (TBP) 會與tau所形成的neurofibrillary tangles (NFTs) 共沉積在細胞質內，表示tauopathy 的致病機轉可能有一部份是透過影響TBP的正常功能而來。由於大部分基因的轉錄都需要TBP的參與，因此我們想知道轉錄缺失是否是tauopathy的致病原因之一，首先我們利用已建立表現正常人類tau蛋白的tauopathy模式果蠅進行藥物實驗，當 我們將tau蛋白表現在這些模式果蠅背甲上時，會造成其背甲剛毛數目的減少，但投以包括SAHA等的HDAC inhibitors藥物時，會降低tau蛋白過量表現所造成的背甲剛毛數量的減少，表示轉錄功能的缺失或許參與在tuaopathies的致病機轉中。我們的實驗結果發現在細胞模式下TBP會與NFTs共同沉積在細胞質內，且TBP促進轉錄的功能也會受到影響。為了在動物模式下也證明我們的實驗，我們創造了表現纖維化tau蛋白的模式果蠅，此種模式果蠅的壽命較野生型果蠅短 。同時我們也發現了這些轉基因果蠅內會表現不可溶的纖維化蛋白。為了證明TBP功能缺失也會發生在我們的模式果蠅中，我們發現 TBP在轉基因果蠅腦中也會與tau蛋白共沈積在一起，與之前的細胞模式實驗結果相同。我們的研究結果將會提供一個治療包括阿茲海默症以及其他tauopathy的契機，透過HDAC inhibitors 藥物的投與，促進基因轉錄以治療tau所造成的TBP功能缺失。Item 兩個TBP結合蛋白－HMGB1和p53參與聚麸醯胺擴增誘導的神經病變(2009) 王孝文; Shiao-Wen Wang脊髓小腦萎縮症第十七型是由於 TATA-box binding protein (TBP) 基因外引子上CAG三核苷酸異常擴增所導致。TBP普遍且廣泛表現在所有型態的細胞，但其N端聚麸醯胺的擴增造成的病理徵狀卻只出現在小腦、皮質等中樞神經。前人的研究顯示人類High mobility group box 1 (HMGB1)和果蠅Dorsal switch protein 1 (DSP1) 在結構上有高度同源性，並且在RNA聚合酶II轉錄上扮演抑制子的角色。HMGB1和DSP1能夠直接和TBP的N端麸醯胺豐富的區域結合，並和結合在TBP上的DNA形成穩定的三元複合體，分別藉由干擾TFIIB和TFIIA與TBP結合，抑制RNA聚合酶II轉錄的啟始階段。本研究的主要目的，在SCA3、SCA17以及HD疾病的果蠅模式下，探討HMGB1和DSP1和聚麸醯胺擴增的蛋白質間交互作用。我們推測，突變的聚麸醯胺蛋白直接和HMGB1結合，並把HMGB1隔離在核內包涵體(intranuclear inclusions)，而HMGB1的功能喪失，使得轉錄功能的喪失，使得活化轉錄功能的失調，導致細胞凋亡以及神經退化病徵。在研究中我們發現過度表現果蠅內生性DSP1干擾了正常的TBP的功能，而過度表現HMGB1則對TBP沒有影響，顯示DSP1和HMGB1雖然具有高度同源性，但在轉錄中扮演的角色不完全相同。另一方面，我們發現補充DSP1和HMGB1 可以顯著的減輕全長的TBP109Q，或是截斷型的聚麸醯胺蛋白如：TBP-109Q NTD、MJD-78Q和Htt-97Q所造成的神經退化。這意味著這些異常擴增的聚麸醯胺蛋白能夠直接與HMGB1作用，並將之隔離在蛋白質聚合體 (aggregates)，而HMGB1喪失的功能可能是聚麸醯胺疾病的致病的普遍原因之一。同時過度表現DSP1和HMGB1增加了和變異的聚麸醯胺蛋白結合的機會，也減少了聚麸醯胺蛋白捕捉其他轉錄因子的數量，使得部分失調的轉錄功能可以恢復。Item TBP蛋白質在聚麩醯胺引起之神經退化性疾病上扮演的角色: 與轉錄失調之關聯(2007) 許敦傑; Ton-Chieh Hsu聚麩醯胺擴增所造成的神經退化性疾病是由於其致病基因的外引子不正常的CAG三核苷酸擴增導致。在細胞及分子的層次上，其致病機轉雖尚未完全釐清，但由近幾年的研究發現轉錄失調為這類疾病的主要原因之一，一般認為聚麩醯胺造成轉錄失調有兩種方式：1.干擾轉錄因子間的交互作用； 2. 把轉錄因子捕捉在包涵體中使其無法作用。TATA box binding protein (TBP)為細胞內重要的轉錄因子，當其胺基端聚麩醯胺擴增時會導致第十七型脊髓小腦共濟失調症 (SCA17)。本研究的主要目的即是利用第十七型脊髓小腦共濟失調症果蠅模式株，來探討異常聚麩醯胺擴增的TBP蛋白質與相關因子對病理症狀有何影響，並釐清TBP在聚麩醯胺擴增造成的神經退化性疾病所伴演的角色。我們研究發現TBP功能為果蠅發育所必需，當其功能缺失時果蠅無法孵化，降低TBP表現或將其功能在特定組織致默後會造成複眼感光細胞退化，運動行為缺陷及壽命減短等性狀，第十七型小腦萎縮症果蠅疾病模式的性狀也會因其功能的缺失而更加嚴重，相對地增加TBP的表現則能有效地改善上述退化及行為等性狀，顯見TBP功能的減少為第十七型脊髓小腦共濟失調症致病機轉的一環。此外由於研究指出High Mobility Group (HMG) 的蛋白質會抑制TBP的轉錄作用，我們也籍由HMG 的同源基因- HmgD來干擾TBP，當HmgD大量表現時果蠅複眼感光細胞確有退化的現象，SCA17果蠅模式動物在此背景下也會加劇其病徵。Item TBP功能缺失參與阿茲海默氏症果蠅模式中之類澱粉蛋白毒性(2015) 鄭建文; Jian-Wen Zheng蛋白質不正常的折疊聚集是許多退化性神經疾病的指標之一，其中也包括阿茲海默症。目前已知阿茲海默症常見的致病原因有二，其一為細胞外β類澱粉蛋白質堆積；另一病徵則為Tau蛋白質堆積所形成的神經纖維狀糾結並造成漸進性的腦皮層萎縮。不正常的蛋白質堆積也是其他退化性神經疾病的常見特徵之一，包括遺傳性的多麩醯胺酸疾病亨丁頓舞蹈症和小腦萎縮症。在上述的這些退化性疾病當中皆有一定比例的不可溶性的轉錄因子TATA box binding protein(TBP)，這些包含麩醯胺酸的不正常折疊堆積也可能是造成阿茲海默症的原因之一。先前已有資料顯示正常野生型的TBP和β類澱粉蛋白質以及Tau蛋白質在阿茲海默症的病人腦中堆積，根據此一證據我們進一步在果蠅模式下實驗證實β類澱粉蛋白質可能透過影響TBP的結合功能或是轉錄功能進而成阿茲海默症的成因之一。我們的研究發現大量表現β類澱粉蛋白質在果蠅的特定組織部位造成許多病理上的症狀，包括複眼細胞的退化、運動行為缺陷及壽命減短等現象；相反地增加TBP的表現則能有效的改善上述退化及行為等性狀，而抑制果蠅內生性的TBP蛋白則使得這些性狀更加嚴重。另外，運用EMSA的方式證實類澱粉蛋白濃度提高造成了TBP對TATA DNA的結合力下降。在果蠅的腦中我們也發現隨著時間上升類澱粉蛋白聚集也因共同表現TBP而減少了聚集的數量，顯示出正常功能的TBP能夠有效的減緩類澱粉蛋白造成的毒性。我們的研究結果顯示出TBP參與阿茲海默症果蠅致病機轉。Item 以SCA17小鼠小腦切片培養及基因轉殖鼠評估HDAC抑制劑對SCA17之效果(2013) 陶育晨; Yu-Chen Tao脊髓小腦萎縮症第十七型 (SCA17) 是一種多麩胺酸造成的神經退化性疾病，是由於在TATA-box binding蛋白基因 (TBP基因) 上有不正常的CAG三核甘酸的擴增，造成TBP蛋白不正常摺疊並聚集在細胞當中，進而產生毒性。在SCA17的病徵上，目前有發現到有運動能力失調、運動功能障礙、認知功能失常等情形。TBP的主要功能是在細胞中啟動轉錄功能，組蛋白去乙醯化酶抑制劑 (HDACi) 可促使基因進行轉錄，因此被引用當作治療SCA17的藥物有其潛力。我們測試了多種HDACi化合物，當中發現LBH589可以在SCA17小腦組織培養上有效地降低TBP蛋白的聚集，然而在活體的實驗上發現LBH589不能有效改善SCA17運動失調的現象。此外，小鼠的食慾以及中樞神經系統發育可能會受到LBH589刺激而造成遲緩。因此，目前我們的活體實驗證據並無法說明LBH589對SCA17之治療是有幫助的。Item 果蠅的TBP功能缺失所導致的細胞凋亡是透過氧化壓力及p53的活化(2013) 楊進勝; Chin-Sern Yong先前研究發現TATA box binding protein gene (TBP) 失去功能，會導致老鼠和斑馬魚早期發育停止及細胞凋亡。TBP如何調控動物發育及細胞凋亡的機制目前並不很清楚的，本論文的主要目的在於研究TBP導致細胞凋亡的性狀在果蠅是否保守，並了解其調控機制，我們發現TBP突變果蠅僅發育至胚胎晚期，且細胞死亡數大量增加。進一步分析TBP缺失細胞即為死亡細胞，顯見TBP對細胞凋亡的調控為自發性的，遺傳分析結果顯示，表現負顯性P53或DIAP1可抑制TBP缺失引起的細胞凋亡，反之大量表視TBP則可抑制P53引起之細胞死亡，顯示TBP為P53引發細胞凋亡作用路徑的成員；此外相較野生型，TBP突變果蠅的總蛋白質量和總核酸量並沒有顯著的減少，顯示TBP可能僅介由影響少數特定基因的表現造成細胞死亡，利用基因微陣列分析，TBP突變果蠅其Prx2540-2基因表現大量降低，Prx蛋白具水解過氧化氫(H2O2)活性，為細胞抵抗氧化壓力之重要成員。實驗發現TBP突變果蠅其過氧化氫濃度相較野生型果蠅為高，且餵食抗氧化劑可有效增長TBP突變株果蠅的生存壽命。綜言之，我們証實TBP功能缺失可籍由活化P53及氧化壓力造成細胞死亡。Item 第二及十七型脊髓小腦共濟失調症之分子檢測及SCA17 TBP擴增淋巴細胞的氧化壓力研究(2006) 陳玢璘; FL Chen摘要 脊髓小腦共濟失調症(SCA)為一群神經退化性疾病，其主要特徵為小腦功能異常，有時也會出現其他神經異常情況，其中第二型及十七型SCA (SCA2、SCA17)和蛋白轉譯區CAG三酸重複擴增相關。SCA17致病基因位於染色體6q27位置，其產物為轉譯起始因子TATA binding protein (TBP)。本研究利用基因型分析(genotyping)技術，首先分析台灣地區包括正常人族群、運動失調症患者、PD患者、AD患者、精神病患者及其他神經疾病族群SCA2、SCA17基因CAG重複範圍，結果於SCA2中發現1個位於正常及擴增範圍邊界的對偶基因(32個重複)，及4個擴增的致病對偶基因(35、40、48及49重複)，於SCA17中則未發現擴增的致病對偶基因，但觀察到5個邊界的對偶基因(44~46重複)。為了了解致病機轉，本研究建立了正常人及SCA17病人的EBV轉型淋巴細胞，並架構了包含 3~61 CAG三核重複的 TBP cDNA，表現於SK-N-SK細胞，利用氧化劑t-butylhydroperoxide (TBH)來檢測這些表現正常與擴增CAG三核重複的細胞對氧化壓力的忍受度。細胞存活及SOD活性定量結果顯示，與表現正常TBP基因的細胞相較，表現擴增TBP基因的細胞對於氧化壓力的忍受度會下降。利用定量蛋白體學方法，比較正常人及SCA17病人淋巴細胞的蛋白表現，初步結果發現一些熱休克蛋白及氧化壓力相關蛋白表現的變異。