學位論文
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Item 轉錄因子SPZ1透過BRAF促進肝癌中的腫瘤生長(2023) 林佳霓; Lin, Jia-Ni肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是一種常見的惡性腫瘤，也是世界上最常見的癌症死亡原因，其預後差且復發率高。然而，目前對於肝腫瘤形成的詳細機制尚不清楚。轉錄因子Spermatogenic leucine zipper 1（SPZ1）是一種致癌基因，在精子發生過程中扮演重要角色，包括細胞生長和分化。先前的研究已發現SPZ1受到上游RAS-MAPK訊息傳遞路徑調控，從而導致癌細胞增生和腫瘤形成。然而，對於SPZ1如何調控下游基因的機制尚不清楚。BRAF為一種致癌基因，透過MAPK訊息傳遞路徑調控癌細胞生長、增生和存活。因此，我們提出SPZ1可能透過BRAF來調控腫瘤生長的假設。我們首先檢測197位肝癌患者的腫瘤與非腫瘤檢體中SPZ1及BRAF表現，結果發現在腫瘤組織中SPZ1與BRAF均有高度表現。另外，我們比較了SPZ1與BRAF表現在肝癌患者中臨床病理特徵的相關性，並進行存活分析，發現高度表現SPZ1與BRAF對於病人的預後較差。此外，我們觀察到SPZ1與BRAF mRNA表現呈中度正相關。為了確認SPZ1是否為BRAF的目標基因，我們利用shRNA在Huh7和SK-Hep1中抑制了SPZ1的表現。結果顯示，當抑制SPZ1表現時，BRAF蛋白質表現也隨之減少。接著，我們將不同片段的BRAF promoter接合上含有Luciferase gene的pGL4質體，並與含有SPZ1的質體共轉染到肝癌細胞株中。透過冷光素酶檢測法，我們發現SPZ1可能與BRAF promoter 的-200到-61位置處結合。最後，我們進一步研究了過度表達SPZ1和SPZ1/shBRAF對肝癌細胞生長的影響。結果顯示，SPZ1可能透過BRAF來調控細胞生長。綜上所述，我們的研究結果顯示，在肝癌發展中，SPZ1扮演著重要的角色，可能透過BRAF來促進細胞增生。未來的研究將繼續探索SPZ1/BRAF訊息傳遞路徑在肝癌細胞發展中的功能。Item 一、BAP1在肝細胞癌中的作用 二、HIOMT在肝細胞癌中的作用(2021) 陳玟秀; Chen, Wen-HsiuBRCA1相關蛋白-1（BAP1）是一種泛素化酶，屬於泛素蛋白羧基末端水解酶亞型家族的成員，已被確認為腫瘤抑制基因。BAP1基因的重要性最初是在侵襲性葡萄膜黑色素瘤腫瘤樣本中檢測到無活性的BAP1突變時確立的。對癌症患者基因缺失數據的分析表明，與BAP1缺乏症相關的綜合症也已擴大到乳腺癌，透明細胞腎癌，肺腺癌，肝內膽管癌和胃腺癌。最近的研究發現，種系等位基因或體細胞突變與這些惡性腫瘤的進展和不良預後正相關。 儘管臨床患者中有許多基因缺失的統計數據，但是BAP1突變或缺失在消化道相關癌症（例如肝癌）中的作用和發病機理還不是很清楚，需要闡明。在這項研究中，我們評估BAP1缺失與癌症進展之間的關係，並檢測其可能的信號傳導機制。首先，我們進行siRNA敲除，以使BAP1失活，並在正常細胞系中過表達BAP1。其次，在上述BAP1失活或過表達的條件下，我們用BrdU和MTT測定法分析癌細胞的生長和活性，通過Boyden Transwell測定法分析細胞的遷移和侵襲，並以西方墨點法分析上皮-間質轉化（EMT）的相關蛋白E鈣黏蛋白和波型蛋白。我們希望這項研究的結果可以提供對BAP1失活在癌症進展中的全面了解，在癌症精準醫療時代提供BAP1突變失活病人可能的治療標靶路徑。Item I. Trip6 蛋白質在小鼠腦中之表現 II. 建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式(2014) 楊程堯; Cheng-Yao Yang壹、 Trip6 蛋白質在小鼠腦中之表現 甲狀腺素受體作用蛋白質 6 (Thyroid receptor-interacting protein 6, Trip6)是一種焦點連接(focal adhesion)分子，它調控一些細胞機制 如：細胞之間的連接(cell adhesion)、細胞的遷移(cell migration)以及 基因轉錄的活化 (gene transactivation)。過去研究指出 Trip6 屬於幹 細胞性(stemness)的基因，在不同的幹細胞中具有較高的表現量。為了探究Trip6 在神經幹細胞所扮演的角色，我們分別檢測了 Trip6 蛋白質在胚胎與成年小鼠大腦中的表現量。發現 Trip6 的 mRNA 主要在胚胎小鼠的腦中有表現，但在成年小鼠腦中則比較低或偵測不到。其蛋白質也只可以在胚胎小鼠的大腦中被偵測到，成年小鼠則否。另外我們在胚胎與成年小鼠的大腦組織切片中，以不同的細胞標誌與 Trip6 進行組織免疫螢光染色。包括幹細胞的標誌 Sox2、增殖中細胞的標誌 Ki67、室管膜細胞的標誌 S100β、神經母細胞的標誌 DCX、神經元的標誌 MAP2、星狀細胞的標誌 GFAP 以及小膠質細胞的標誌(Iba1)。我們發現 Trip6 主要表達在胚胎小鼠的腦室區(ventricular zone, VZ)以及出生後小鼠的腦室下區(subventricular zone, SVZ)內的神經幹細胞(neural stem cells, NSC)中。這樣的結果支持Trip6 可能在調控幹細胞的特性中是一個重要的關鍵。 貳、建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式 神經膠質母細胞瘤是成人最常見且高侵略性的原發惡性腦腫瘤。它的侵襲力和耐傳統療法使其成為極易復發的惡性腫瘤。Rac蛋白質屬於Rho GTP酶亞家族，其主要功能包括調節細胞運動，增殖和存活。為了探究Rac蛋白質是否可以作為膠質母細胞瘤的新治療標靶，特別是對於神經膠質母細胞瘤幹細胞，我們利用其類癌幹細胞株建立了斑馬魚的異體移植模式來研究抑制Rac蛋白質對於神經膠質母細胞瘤的致癌性影響。 我們將表達控制組的shRNA或者是針對Rac蛋白質做抑制的shRNA序列和綠螢光蛋白的神經膠質母細胞瘤細胞株U251-MG和U373-MG培養於低分化培養液中，以形成腫瘤細胞球(tumorspheroids)。這些體外培養的球體細胞有著幹細胞的特性。我們將這些細胞以顯微注射的方式注射進入受精後兩天大的血管紅螢光轉基因斑馬魚Tg(kdr: mCherry)的卵黃囊。觀察發現注入的癌細胞誘導了血管新生作用的發生，而表達shRacs細胞萎縮且並未引發血管新生作用。另外，注射shRacs細胞的魚隻生存率也較高。 從我們的研究結果，Rac蛋白質會誘導膠質瘤幹細胞引發血管新生作用，並且可做為一個生物標誌。因此，Rac蛋白質可能可以進一步應用在神經膠質母細胞瘤的標靶治療上。 另一方面，我們也利用注射肝癌細胞株Hep3B進入受精後兩天大的斑馬魚卵黃囊中，來觀察Hep3B細胞的遷移現象，此模式約有20%的魚隻可觀察到細胞遷移。Item 中草藥M1抗肝癌之研究(2018) 傅乙晏; Fu, Yi-Yan肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma）是目前人類常見的惡性癌症之一，據統計肝癌致死率二十年來是台灣癌症主要死因。主要致癌因子包含了肝炎病毒感染和其他原因如酒精濫用、黃麴毒素的攝取等。 目前以中草藥治療疾病機轉的研究獲得重視，本研究中以Huh7肝癌細胞株來檢測中草藥對於肝癌細胞的血管新生作用及轉移作用是否能有效抑制。結果，由10種中藥發現M1中草藥能夠以低於細胞生存率(Cell Viability)濃度的一半濃度以下有效抑制Huh7的細胞遷移能力(Migration)。中草藥M1 針對細胞膜上的受器酪胺酸激酶 (Receptor Tyrosine Kinase，RTK)中的表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)有效抑制其磷酸化，並且抑制其下游分子AKT (Protein Kinase B，PKB)、mTOR (mammalian target of rapamycin)、HIF1-α(Hypoxia-inducible factor 1-alpha) 和VEGF-A(Vascular Endothelial Growth Factor A)的表現。EGFR下游路徑蛋白 Ras (Rat sarcoma) 、 ERK (extracellular signal–regulated kinases)、轉錄因子Snail亦有被抑制表現。細胞轉移機制中，可分解細胞外基質(Extracellular Matrix，ECM)蛋白的酵素，基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)中的MMP-2、MMP-9在細胞外活性和表現量能夠被有效的抑制和減少。Epithelial–mesenchymal transition (EMT) 中的指標蛋白，如: E-cadherin和N-cadherin表現量也有改變，抑制細胞的遷移能力。本研究也藉由免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)建立腫瘤模式，並以口服M1來觀察是否可在活體(in vivo)內抑制腫瘤生長，結果在腫瘤生長大小、重量、蛋白表現上都被有效抑制，M1確實可在活體中抑制腫瘤生長。總結研究結果可，中草藥M1有其發展抗癌藥物的潛力。