學位論文

Permanent URI for this collectionhttp://rportal.lib.ntnu.edu.tw/handle/20.500.12235/73908

Browse

Subject: search.filters.subject.Autophagy

Search Results

Now showing 1 - 7 of 7
  • No Thumbnail Available
    Item
    以果蠅模式研究皰疹病毒出核蛋白BFRF1減緩蛋白質包涵體毒性之機制
    (2024) 許鈺暄; Hsu, Yu-Hsuan
    常見多麩醯胺酸異常擴增蛋白質引起的神經退化性疾病，有脊髓小腦共濟失調症、亨丁頓舞蹈症、齒狀紅核蒼白球萎縮症和脊髓延髓性肌肉萎縮症，這些神經退化性疾病的共同病理特徵，為神經細胞中多麩醯胺酸擴增蛋白所形成包涵體的累積，不正常蛋白折疊所形成包涵體的角色，是為疾病的成因或結果尚有爭議，但許多研究發現減少錯誤折疊蛋白質的合成，促進清除蛋白質聚集體，或降低蛋白質聚集體所產生的毒性，皆可有效減緩這類神經退化性疾病。先前研究發現，人類疱疹病毒第四型的 BFRF1 蛋白可誘導的囊泡形成，選擇性地吞噬細胞核內蛋白包涵體，促進神經母細胞瘤細胞核中突變 Huntingtin (Htt)蛋白包涵體的運送和清除。為了進一步了解 BFRF1 蛋白質能否在動物體中有類似效果，本研究利用第三型脊髓小腦共濟失調果蠅模式，測試BFRF1蛋白是否可減緩多麩醯胺酸擴增包涵體的蛋白毒性。我們發現過量表現BFRF1蛋白質，本身並不影響果蠅複眼發育，而 Atxn3 蛋白質所引起的果蠅視網膜神徑細胞退化，可因BFRF1蛋白質表現而緩解，BFRF1 蛋白質也可減少果蠅中可溶性和不溶性的 Atxn3 蛋白質。儘管壽命沒改善，但 BFRF1 蛋白質可增加第三型脊髓小腦共濟失調果蠅模式的運動功能。這些結果說明 BFRF1 蛋白質能在果蠅中抑制突變 Atxn3 蛋白的毒性，其作用可能藉誘導囊泡形成，透過細胞自噬途徑，清除選吞噬蛋白質包涵體。
  • No Thumbnail Available
    Item
    研究新穎化合物上調第三型小腦萎縮症SH-SY5Y细胞自噬降解突變ATXN3蛋白的治療作用
    (2023) 許少凡; Hsu, Shao-Fan
    聚麩醯胺(polyQ)介導的脊髓性小腦共濟失調(SCA)是由編碼polyQ束的CAG三核苷酸重複序列異常擴增引起的異質性退化性疾病。錯誤折疊和聚集的polyQ蛋白是polyQ疾病的一個共同特徵，會導致神經元功能障礙和退化。在SCA中，第三型脊髓性小腦共濟失調症(SCA3)是全球最常見的形式。SCA3的特點是染色體14q32.1上ATXN3基因的CAG重複擴增，在正常個體中重複次數為10至44次，在大多數臨床診斷患者中則重複61至87次。由於擴增的polyQ蛋白的積累可能是致病性的初始事件，因此通過自噬清除聚集蛋白，被認為可以抑制廣泛的下游有害作用，以促進神經細胞存活。因此，本研究旨在尋找可以通過激活自噬作用來清除聚集的ATXN3/Q75的潛在化合物。共測試了10種化合物，包括5種吲哚衍生物和5種香豆素衍生物。其中，吲哚衍生物NC009-1、-2、-6和香豆素衍生物LM-031在Thioflavin T結合和點印跡分析中，會抑制大腸桿菌衍生的ATXN3/Q75蛋白聚集。使用誘導DsRed-LC3表達的HEK-293螢光報告細胞，發現NC009-2、-3和LM-031的處理顯著誘導了DsRed-LC3向自噬體的募集。在ATXN3/Q75-GFP SH-SY5Y細胞中，與未處理的細胞相比，NC009-1、-2、-6和LM-031顯示出良好的聚集抑制潛力，及改善神經突生長，而NC009-1、3、6和LM-031降低ATXN3/Q75蛋白表達後上升的活性氧化物。NC009-1、-2、-6和LM-031通過增加細胞中磷脂醯乙醇胺(PE)偶聯的LC3-II/細胞質LC3-I的比率來啟動自噬。該研究結果可能提供polyQ介導的疾病治療策略的參考。關鍵詞：第三型脊髓性小腦共濟失調症、聚麩醯胺、ATXN3、自噬作用
  • No Thumbnail Available
    Item
    KIF12在大腸癌細胞中調控自噬作用與細胞外囊泡形成之角色
    (2022) 陳麗年; Chen, Li-Nian
    驅動蛋白家族成員 12（Kinesin Family Member 12；KIF12）是一種微管相關的運動蛋白，在細胞分裂及囊泡運輸中扮演重要角色。我們之前發現 KIF12 的表現量在大腸癌的組織比起正常組織有升高的現象，並且會促進大腸癌幹細胞的增殖。為更了解 KIF12 對大腸癌細胞的調控，我們進一步探討其對細胞自噬作用(autophagy)與外泌體(exosome)生成之影響。細胞中自噬作用泛指將細胞質內容物吞噬，形成自噬泡並送至溶酶體內降解的路徑，它的功能主要在於分解細胞內異常摺疊或堆積的蛋白質以及清除老化的胞器。細胞中自噬作用異常與癌症、神經及心血管退化性疾病形成皆有相關。外泌體是由內體(endosome)衍生的多囊泡體產生，包裹部分細胞內容物後分泌到細胞外。有研究指出外泌體的形成與自噬作用在維持細胞穩定及腫瘤細胞轉移中有協同作用。為深入探討 KIF12 是否調節大腸癌細胞以及其癌幹細胞自噬與外泌的能力，我們利用Lipofectamine 2000 將削弱 KIF12 的 shRNA 轉染至SW480(shKIF12)，並利用 CRISPR 系統建立剔除 KIF12 的穩定細胞株(CR-KIF12)，來探討 KIF12 對此二功能之影響。我們以 GFP-LC3融合蛋白質表現載體及酸性胞器染劑 Lysotracker red 來偵測細胞自噬作用。同時，我們利用外泌體的報告質體 PalmGRET reporter 來偵測細胞外泌體的生成與 KIF12 蛋白質之相關性。結果發現降低KIF12 的表現會抑制細胞因饑餓引發的自噬作用與外泌體生成。
  • No Thumbnail Available
    Item
    營養缺乏對神經瘤母細胞轉殖入PPP2R2B的影響
    (2011) 李蕙芳; Hui Fang Li
    蛋白磷酸酶2A (PP2A) 是絲胺酸/酥胺酸去磷酸酶，由催化次單元、骨架次單元與調控次單元所組成的三體蛋白。其中PPP2R2B (Bβ)是特別作用在腦部的調控單元，會經由選擇性剪接後，生成兩種蛋白異構物：Bβ1與Bβ2。前者表現於細胞質中，後者表現於粒線體。過去研究顯示，異常表現PP2A的細胞與神經退化疾病的發生有關。過去本實驗室以SK-N-SH轉殖入Bβ1基因與Bβ2基因建立穩定細胞株。實驗顯示Bβ1與Bβ2是藉由細胞自噬(autophagy)方式維持細胞生存。過去的研究中發現，這類轉殖的穩定細胞會受外來氧化壓力的影響，並在細胞自噬相關基因失活時提高其細胞存活。 過去的研究中顯示，細胞株在飢餓壓力下，會以細胞凋亡維持細胞存活。本計畫以HBSS (Hank’s Balanced Salts Solution) 作為細胞飢餓壓力的來源。研究結果顯示轉殖Bβ1的SK-N-SH細胞在HBSS環境會促使細胞自噬。並試以細胞自噬抑制劑20μM 3-MA處理，發現3-MA可抑制因飢餓壓力所造成的細胞自噬，進而減少後續的細胞凋亡，而使細胞的存活提高，但是抑制lysosome及autophagosome的抑制劑Bafilomycin A1，則沒有減少後續細胞凋亡的效果。此外，添加胺基酸glutamine可以減少的細胞自噬，進而降低細胞凋亡，但非必需胺基酸(NEAA)則無此效果。 此項研究可對於研究神經細胞異常表現PPP2R2B後，在不同環境壓力下，提供更好的研究模式及瞭解細胞自噬生成機制。
  • No Thumbnail Available
    Item
    環境壓力對於神經母細胞過度表現細胞質或粒線體PPP2R2B之影響
    (2012) 宋亭潔; Ting-Chieh Sung
    Protein phosphatase 2A (PP2A)是serine/threonine去磷酸酶的一種，能調節細胞的生長、存活和凋亡。哺乳類動物中，Bβ次單位PPP2R2B是PP2A在腦神經細胞中的專一表現的次表型。當 Bβ基因有所缺失或過度表現時，會造成神經細胞的病變。本研究使用可以持續且穩定過度表現細胞質PPP2R2B蛋白(Bβ1)及粒線體 PPP2R2B蛋白(Bβ2)的神經細胞株，觀察飢餓壓力、低氧環境和Tunicamycin(TM)等藥物引起的內質網壓力，對細胞表型的影響。 研究結果顯示Bβ1細胞在飢餓壓力下，其粒線體膜電位及存活率都會下降，而sub-G1期比例也有顯著提升，代表產生細胞凋亡。但若以細胞自噬抑制劑Bafilomycin A1預處理，則會抑制因飢餓壓力引起的細胞自噬，進而減緩後續的細胞凋亡，但3-methyladenine (3-MA)則無此效果。 另一方面，Bβ2細胞株的存活率會因為受到內質網壓力而有下降，由流式細胞儀及螢光免疫染色發現細胞內的酸性液泡會增多，代表有細胞自噬增加，但Bβ1細胞株則否。但以細胞自噬抑制劑3-MA先對細胞作前處理24小時後，再施以內質網壓力，則各Bβ2細胞株的sub-G1 期比例皆會降低，而酸性液泡胞器的密度也明顯降低。 此外，在低氧壓力對於過度表現PPP2R2B的蛋白，無論是細胞質或粒線體，皆會造成sub-G1 期上升，引發不同程度的細胞凋亡。 本論文針對過度表現PPP2R2B的細胞株分別由飢餓壓力、內質網壓力和低氧環境下，觀察細胞所產生的表型變化，模擬PPP2R2B過度表現之神經退化病變的產生，並瞭解病變機制，祈能對PPP2R2B相關疾病的研究與治療有所助益。
  • No Thumbnail Available
    Item
    第一型糖尿病與高血壓引起勃起功能障礙之病理機制與治療策略
    (2015) 廖品豪; Pin-Hao Liao
    研究背景：高血壓與糖尿病為現代人常見之文明病。高血壓與糖尿病造成男性勃起功能障礙可能是因血管、神經與平滑肌病變和內分泌睪固酮失調所致。我們推論其造成勃起功能障礙的病生理機轉為：長期高血壓與高血糖環境可能會增加活性氧產生而(1)引起發炎反應，(2)降低陰莖海綿體之一氧化氮產生與作用，(3)增加活性氧產生會氧化大分子如DNA、脂質與蛋白質造成陰莖海綿體內神經、血管與平滑肌肉細胞進行三種計畫性細胞死亡如細胞自噬、細胞凋亡與發炎性細胞死亡，(4)直接影響勃起功能之海綿體神經發生生理失調與病理結構病變而無法刺激陰莖海綿體之勃起，(5) 影響Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)/NF-E2-related factor (Nrf-2)/Heme-oxygenase 1 (HO-1)表現與訊息途徑而造成勃起功能障礙。 研究方法：本研究利用正常血壓之WKY成年雄鼠與自發性高血壓之成年雄鼠。實驗分成四組：正常血壓WKY組(N=6)，糖尿病WKY組 (N=6)，高血壓SHR組 (N=6)與糖尿病合併高血壓SHR組 (N=6)。我以腹腔注射鏈佐霉素 (Streptozotocin，65 mg/kg)誘發第一型糖尿病。記錄海綿體內壓觀察代謝症候群老鼠的海綿體勃起功能，以高感度化學發光偵測儀定量血液中活性氧數量觀察氧化壓力變化，以組織免疫染色與西方墨點法觀察三種計畫性細胞死亡包括細胞凋亡、細胞自噬與發炎性細胞凋亡相關蛋白的表現與作用，以及一氧化氮量測儀觀察組織內一氧化氮變化量。我亦探究一氧化氮前驅化學物質與內皮一氧化氮合成酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS）抑制劑對勃起功能之影響。 研究目的：為釐清糖尿病與高血壓引起男性勃起功能障礙的病理機轉，並建立找尋新型治療策略的動物生理模式。 研究結果：結果顯示高血壓組(ΔICP/MAP = 0.22±0.02, N=6)與糖尿病組(ΔICP/MAP = 0.27±0.01, N=6)之陰莖海綿體勃起功能顯著低於控制組(ΔICP/MAP = 0.33±0.01, N=6)，且同時罹患高血壓與糖尿病的組別有更低之陰莖海綿體勃起功能(ΔICP/MAP = 0.20±0.02, N=6)。高血壓組(lucigenin ROS = 784±452 counts/120 sec, N=6；luminol ROS = 741±132 counts/120 sec, N=6)與糖尿病組(lucigenin ROS = 643±192 counts/120 sec, N=6；luminol ROS = 393±158 counts/120 sec, N=6)之氧化壓力壓顯著高於控制組(lucigenin ROS = 445±160 counts/120 sec, N=6；luminol ROS = 117±74 counts/120 sec, N=6)，且同時罹患高血壓與糖尿病的組別有更高的氧化壓力(lucigenin ROS = 5820±259 counts/120 sec, N=6；luminol ROS = 4550±1537 counts/120 sec, N=6)。靜脈注射左旋精氨酸後各組勃起海綿體內壓與海綿體一氧化氮量皆有提高。控制組在注射人工合成的一氧化氮提供劑CCL5後亦有較高的勃起海綿體內壓。注射內皮一氧化氮合成酶(eNOS) 拮抗劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-Nitro-L-Arginine methyl ester hydrochloride, L-NAME)會明顯降低所有組別之勃起海綿體內壓。與控制組比較，糖尿病會增加發炎指標（Cluster of Differentiation 68 , CD68）、細胞凋亡蛋白cleaved-Caspase-3、細胞自噬蛋白Beclin-1、與保護性蛋白Nrf-2之表現。與控制組比較，高血壓亦增加發炎指標CD68、細胞凋亡蛋白cleaved-Caspase-3、細胞自噬蛋白Beclin-1、與保護性蛋白Nrf-2和HO-1之表現。而糖尿病合併高血壓組別有更高之發炎指標CD68、細胞凋亡蛋白cleaved-Caspase-3、細胞自噬蛋白Beclin-1、與保護性蛋白Nrf-2和HO-1之表現。在陰莖海組織染色也一致性發現糖尿病、高血壓或是糖尿病合併高血壓會造成陰莖內神經、海綿體和血管組織增加白血球浸潤、CD68單核球（Monocyte）數目、肥大細胞（Mast Cell）數目、細胞凋亡與細胞自噬數目與纖維化程度而eNOS表現則降低。 結論：綜合以上實驗結果，代謝症候群引起勃起功能失常可能是透過氧化壓力、發炎、細胞凋亡與細胞自噬的增加，雖然Nrf-2/HO-1保護機制有略為增加但不能對抗嚴重的傷害程度。給予CCL5及左旋精氨酸可以改善勃起功能。
  • No Thumbnail Available
    Item
    傳統中醫藥對於發炎性疾病的治療潛力
    (2016) 蔡文興; Tsai, Wen-Hsin
    氧化壓力的增加，誘發多個組織/器官的發炎，導致細胞死亡和長期傷害。傳統的中醫學（TCM）具有抗氧化，抗發炎，抗凋亡和自噬調控功能已被廣泛地用在現代醫學中的預防或治療策略。氧化壓力和發炎已經被廣泛報導有關於臨床上所見P物質介導的神經源性膀胱過動。 為了改善膀胱過動症，我們探討潛在的藥物和神經源性膀胱機制。 P物質（SP）會藉由興奮膀胱的感覺傳入神經和細胞間粘附分子-1（ICAM-1）介導白血球粘附和活性氧族（ROS）產物的增加引起的膀胱過動。八味地黃丸（BWDHW）是一種傳統的中草藥複方，一直使用來治療罹患下尿路症狀的患者，但作用機轉並不清楚。我們在本研究探討其中的活性成分及BWDHW對於SP誘發膀胱活動過度的影響。結果顯示，BWDHW是經由loganin抑制SP /神經激肽-1(NK-1)受體信號傳導，降低NF-κB/ ICAM-1介導白血球粘附和浸潤和ROS水平，因而改善膀胱過動症狀。 我們也探討L-茶氨酸對於P物質誘導的促炎信號PKC / ERK / NF-κB/ ICAM-1 / IL-33，白血球浸潤和粘附，活性氧（ROS）產物，自噬和凋亡對膀胱過動的療效。總之，口服L-茶氨酸確定能藉由抑制促炎信號，氧化壓力，膀胱神經活性，細胞凋亡和自噬，改善P物質誘導的膀胱過動。