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Item 探討黃芩素衍生物於神經細胞及阿茲海默動物模式小鼠之作用(2024) 吳嘉旋; Wu, Chia-HsuanItem 使用Aβ折疊報告細胞篩選靶向ERK及AMPK/EEF2K訊息的合成化合物作為新穎阿茲海默症治療策略(2023) 祁舜慈; Chi, Shun-Tzu阿茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一種與年齡相關的神經退化性疾病，會逐漸的破壞記憶力以及學習能力，其主要病理特徵有大腦中β-澱粉樣蛋白(Aβ)堆積形成的斑塊，以及過度磷酸化tau蛋白所形成的神經纖維纏結。其中Aβ的堆積會損害神經元的突觸可塑性、增加細胞內的活性氧物質，並對神經元造成損害，因此開發AD藥物的其中一種方法，便是防止Aβ的堆積或阻斷Aβ寡聚體的神經毒性。研究有發現，在AD患者的CA1腦區中，編碼核糖體蛋白的基因受到異常的調節，其中與蛋白質的合成有關的真核延伸因子2 (Eukaryotic elongation factor 2, EEF2)在AD疾病中出現下調。EEF2在神經元的存活中起到重要的作用，可維持突觸可塑性。在真核細胞轉譯的過程中，EEF2的活性受到嚴格的控管。真核延伸因子2激酶(Eukaryotic elongation factor 2 kinase, EEF2K)藉磷酸化EEF2的T56位點抑制其活性，來調控轉譯的過程。EEF2K的活性受多種訊息路徑調控，如AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)及細胞外訊息調節激酶(Extracellular-signal regulated kinase, ERK)。AMPK的訊息傳導可透過磷酸化S398位點來活化EEF2K，促使EEF2磷酸化失活，從而減少蛋白質合成；而ERK可透過磷酸化S366位點來抑制EEF2K的活性，使EEF2去磷酸化活化，來促進蛋白質的合成，如：腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)。本論文利用Aβ折疊報導細胞Aβ-GFP SH-SY5Y細胞，探究吲哚衍生物(Indole derivatives: NC009-1, -3, -6, -11)及香豆素衍生物(Coumarin derivatives: LM-016, -021, -022, -036)，改善Aβ錯誤折疊的情形及神經保護作用。在八種測試的化合物中，除NC009-3外，所有化合物均符合Lipinski預測口服生物利用度的標準。根據計算出的極性表面積和血腦屏障滲透評分，八種化合物皆被預測為可滲透血腦屏障。所檢測的化合物皆可改善Aβ的錯誤折疊以及相關的氧化壓力。此外，前處理NC009-1、NC009-6及LM-021、LM-036可有效降低凋亡蛋白酶-3/6以及抑制乙醯膽鹼酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)的活性，並促進神經突生長。接下來，為了解化合物促進細胞中蛋白質合成之作用機制，使用嘌呤酶素標定的轉譯的表面傳感(Surface sensing of translation, SUnSET)分析法，發現NC009-1、LM-021及LM-036的處理可增加細胞中新合成的蛋白質。此外，NC009-1增加了p-ERK (T202/Y204)和p-EEF2K (S366)的表達，LM-021降低了p-AMPK (T172)和p-EEF2K (S398)的表達，而LM-036同時作用於兩條途徑，增加EEF2K的S366磷酸化並減少S398磷酸化，從而導致EEF2K活性降低。隨後對應的p-EEF2 (T56)抑制活性的降低，增強了p-CREB (S133)及其下游BDNF、BCL2蛋白的表達，並促進神經突生長。研究結果可作為開發新穎且有潛能的阿茲海默症治療策略的參考。Item 使用模式鼠探討益生菌Lacticaseibacillus paracasei PS23對阿茲海默症的腸道微生物與海馬迴基因表現影響(2023) 張清華; Chang, Ching-Hwa阿茲海默症 (Alzheimer’s Disease, AD) 是最常見的神經退化性疾病之一，影響患者記憶、思考和行為。研究指出腸道和大腦之間有一個雙向的通道，稱為腸腦軸。近期越來越多研究指出腸道菌群的失調與AD有關聯，但腸道菌群在AD發病機制的作用仍有許多未明之處。此外有研究發現，益生菌可以通過腸腦軸改善腸道菌群的失調進而調整腦部功能。 Lacticaseibacillus paracasei PS23 是一種從健康人類糞便中分離出來的益生菌，多項研究指出PS23可以改善認知功能、衰老和憂鬱症。然而，PS23 對 AD 的影響仍未有報導。我們在稍早的研究中已經確認PS23可以改善AD小鼠之認知功能，在此研究中，我們分析益生菌 PS23 是否改變AD模式小鼠腸道微生物群組成和海馬迴基因表達。我們發現PS23能提升AD小鼠代謝、免疫功能、以及短鏈脂肪酸相關的腸道微生物群豐度。另外，PS23活菌也有提升短鏈脂肪酸的濃度。PS23活菌以及熱殺菌皆有改變SRP54、P2Y2R、growth hormone、prolactin的基因表達程度。因此，我們推測PS23活菌可以透過增加短鏈脂肪酸而降低AD小鼠中的發炎，而PS23熱殺菌可能以透過提升growth hormone來增加神經新生，而PS23活菌以及熱殺菌可能透過增加prolactin表現量而增加記憶及認知功能以改善AD之病徵。綜合上述結果，我們認為PS23具有預防與治療AD的潛力。Item 探討中草藥純物質 PN 衍生物作為治療阿茲海默氏症藥物之開發與機轉(2023) 陳品蓉; Chen, Pin-Jung阿茲海默症 (Alzheimer’s disease, AD)是常見的神經退化性疾病之一， 罹患的人數隨著人口邁向高齡化社會而逐漸增加，患者會有記憶、學習以及語言能力的缺失。 為了開發治療藥物，我們之前利用 DiBAC4(3)膜電位螢光染劑， 篩選可以減緩 Aβ 寡聚體誘導神經細胞發生不正常去極化的純物質， 藉此平台得到一種源自白芍中草藥的純物質，暫時命名為 PN，已發現 PN 會透過調節NMDA receptor 減緩 Aβ 寡聚體所導致的神經細胞不正常去極化。 本研究旨在以 PN 為基底尋找有效或更有效之 PN 衍生物。 目前階段篩選了 6 種 PN 衍生物暫時命名為 PN1~PN6，發現其中的 PN4 可以改善 Aβ 寡聚體所誘導的神經細胞不正常去極化， PN4 具有類似 AMPA 受體拮抗劑以及 NMDA 受體拮抗劑的特性，可以改善 AMPA 及 NMDA 所導致的神經細胞不正常去極化， 藥物機轉則發現 PN4 能降低 Aβ 寡聚體以及 NMDA 所誘發之上升的磷酸化 ERK 分子；使用阿茲海默症模式小鼠 J20， 以皮下注射方式給予小鼠 PN4， 其對於小鼠的基本生理參數像是體重、發炎指標 GOT、 GTP 以及肝腎組織切片觀察， 皆不會有不良影響， 進一步在動物行為方面發現， 模式小鼠在給予 PN4 後，其在巴恩斯迷宮所檢測之學習記憶以及新物體辨識之辨識記憶並無改善效果，但在莫氏水迷津所檢測之長期空間記憶方面則有顯著的改善。 綜合以上， PN4 可能透過拮抗 AMPA 受體以及 NMDA 受體， 藉以減緩 Aβ 寡聚體所導致的神經細胞不正常去極化，且改善阿茲海默症模式小鼠 J20 長期記憶缺失的現象， 希望最終能開發一種對於治療阿茲海默症患者有所助益的藥物。Item 利用ΔK280 TauRD折疊報導細胞篩選TRKB促效劑作為阿茲海默症治療策略(2022) 翁鉦逵; Weng, Zheng-Kui阿茲海默症(AD)為一種常見的與年齡相關的神經退化性失智症。其病理特徴包含在大腦中存在澱粉樣蛋白-β (Aβ)斑塊和神經纖維纏結(NFTs)的慢性累積。NFTs是由成對螺旋絲(PHF)在神經元內累積而成，而PHF主要是異常過度磷酸化Tau蛋白組成，會誘導一系列毒性事件，最終導致神經元變性和損傷。腦原性神經營養因子(BDNF)為一種神經營養因子。BDNF與其特異性受體原肌球蛋白相關激酶B (TRKB)結合後，導致TRKB二聚化和活化，隨後活化下游訊號，影響cAMP反應元件結合蛋白1 (CREB)在內的蛋白，來促進神經元存活和增加神經可塑性。證據顯示，在AD患者的大腦中BDNF和TRKB的表達量降低，因此增強TRKB訊號被認為是有希望的治療策略。本研究使用表達ΔK280 TauRD-DsRed促Tau錯誤折疊聚集的人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，評估8種化合物抑制Tau錯誤折疊的情形。檢測的化合物中，香豆素衍生物ZN-015和喹啉衍生物VB-030和VB-037可減少細胞內ΔK280 TauRD聚集，並促進神經突生長。通過抑制細菌衍生的ΔK280 TauRD-His在生化分析中的聚集，ZN-015、VB-030和VB-037顯示出化學伴侶活性。此三者雖皆不具DPPH自由基捕捉能力，但ZN-015具氧自由基吸收能力。另外，ZN015、VB-030和VB-037抑制了凋亡蛋白酶-1 (Caspase 1)及/或乙醯膽鹼酯酶(AChE)活性。進一步的TRKB訊息傳遞路徑分析顯示，處理ZN-015、VB-030、VB-037後，細胞內p-TRKB (Y516)、p-TRKB (Y817)、p-AKT (S473)、p-ERK (T202/Y204)、p-RSK (S380)、p-CaMKII (T286)、p-CREB (S133)、BDNF、BCL2蛋白表現顯著增加，並伴隨著凋亡調節蛋白BAX的顯著降低。以TRKB的干擾性核糖核酸(RNAi)靜默TRKB基因表現後，可抑制ZN-015、VB-030、VB-037的促進神經突生長。色氨酸螢光猝滅分析(Tryptophan fluorescence quenching assay)顯示，ZN-015、VB-030、VB-037與畢赤酵母表達的TRKB胞外結構域(TRKB-ECD)直接相互作用，支持其透過TRKB訊號發揮作用。這些化合物作為TRKB促效劑的研究，能為AD提供新的治療策略。Item 利用Aβ折疊報導細胞篩選黃酮及香豆素衍生物作為促效劑標的BDNF受體TRKB的阿茲海默症治療策略(2021) 黃鏡嘉; Huang, Ching-Chia阿茲海默症(AD)是與記憶缺陷和認知功能下降相關的進行性神經退行性疾病。病理學上AD的特徵是大腦中存在澱粉樣蛋白β (Aβ)聚集體(澱粉樣斑塊)和由高磷酸化的Tau蛋白形成的神經原纖維纏結(NFT)。腦源性神經營養因子(BDNF)是神經營養蛋白家族的成員，以高親和力與原肌球蛋白相關的受體激酶B (TRKB)結合，活化下游信號傳導，來促進神經元的存活、分化和神經可塑性。已經發現AD患者的腦中BDNF和TRKB表達水平降低，並且BDNF降低和TRKB受損導致AD中的神經變性。AD小鼠模型的海馬迴中施用TRKB特異性促效劑7,8-二羥基黃酮(7,8-DHF)，可改善了空間記憶並降低樹突損傷，表明TRKB信號傳導增強，為有希望的AD治療策略。本研究使用表達Aβ-GFP的人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，對15種黃酮和香豆素衍生物，進行Aβ聚集抑制性及神經保護性的評估。在測試的化合物中，ZN006、ZN013、ZN014、ZN015可抑制Aβ蛋白聚集、降低活性氧化物(ROS)、及抑制乙醯膽鹼脂酶(Acetylcholinesterase)活性，其中ZN014、ZN015並能抑制凋亡蛋白酶-1 (Caspase-1)活性及促進神經突生長(Neurite outgrowth)。在TRKB訊息傳遞路徑上，ZN014、ZN015可透過TRKB受體的Y516、Y817磷酸化，及下游ERK激酶T202/Y204磷酸化、AKT激酶S473磷酸化的活化，進一步促進轉錄因子CREB的S133磷酸化，來增強神經營養因子BDNF及抗凋亡蛋白BCL2的表現。RNA干擾(RNAi)靜默TRKB基因表現的實驗，驗證了這兩種化合物經由TRKB訊息傳遞的神經保護性。總言之，研究結果顯示ZN014和ZN015可抑制氧化壓力及乙醯膽鹼脂酶活性，並增強BDNF-TRKB訊息，來降低Aβ毒性，有潛能應用在AD的治療上。Item 利用CRE motifs報導細胞和Aβ-GFP細胞篩選BDNF受體TRKB的小分子促效劑做為阿茲海默症治療策略(2019) 鄧伃珊; Teng, Yu-Shan阿茲海默症(Alzheimer's disease, AD)，是一種與年齡相關的神經退化性疾病，會逐漸破壞認知功能、記憶和思考能力。腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)，透過活化高親和力受體--旋轉肌凝蛋白相關蛋白質激酶B (Tropomyosin-related kinase B, TRKB)，並隨後磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白1 (cAMP responsive element binding protein 1, CREB)，來調節神經元存活(Neuronal survival)、新生(Neurogenesis)和神經可塑性(Neuroplasticity)。前人的研究發現BDNF和TRKB在AD患者腦中的表現量降低，且Aβ顯著下調BDNF、TRKB水平與降低CREB磷酸化。TRKB促效劑7,8-二羥基黃酮(7,8-Dihydroxyflavone, 7,8-DHF)，可改善AD小鼠模型的記憶缺陷。此外，黃芩素(Wogonin)透過增加BDNF和CREB表現，可提升海馬迴神經元缺失和認知功能障礙。這些證據顯示大腦中BDNF-TRKB訊息傳遞與AD的關聯性，因此增強TRKB訊息傳遞是有潛力的AD治療策略。先前本實驗室與本校化學系孫英傑老師合作，透過化合物數據庫的化合物相似性搜索進行虛擬篩選，得到DHFS-1 (即Quercetin)、DHFS-2、Kaempferol、Apigenin等4個7,8-DHF類似物。本研究以7,8-DHF為控制組，檢測Wogonin及這4個類似物作為TRKB促效劑的潛能。首先檢測化合物的溶解度(Solubility)，預測化合物的口服生物利用度(Oral bioavailability)、中樞神經系統有效性(CNS-activity)與血腦屏障通透性(Blood brain barrier permeability)，並檢測化合物捕捉自由基和抑制Aβ聚集的能力。之後建立人類CRE motifs驅動GFP表現的293報導細胞，由上述6個化合物中篩選出能顯著提升CREB轉錄活性的7,8-DHF、DHFS-1、DHFS-2、Apigenin。再利用誘導表現Aβ-GFP的人類SH-SY5Y細胞，檢測所篩選出的潛力TRKB促效劑的神經保護作用。7,8-DHF、DHFS-1、DHFS-2、Apigenin四者皆有抑制Aβ蛋白聚集、降低活性氧化物(ROS)以及促進神經突生長(Neurite outgrowth)之能力。四者中DHFS-1、DHFS-2、Apigenin可抑制凋亡蛋白酶-1 (Caspase-1)的活性，7,8-DHF、Apigenin可抑制乙醯膽鹼脂酶(Acetylcholinesterase)活性。此外，TRKB的RNA干擾(RNAi)作用，會抑制7,8-DHF、DHFS-1、DHFS-2、Apigenin促進神經突生長能力。因此除了已知的7,8-DHF外，DHFS-1、DHFS-2、Apigenin也可能是透過TRKB訊息傳遞來促進神經保護作用。本研究將衍生新穎TRKB促效劑，以期提供阿茲海默症治療策略。Item 研究果蠅PP2A B次單元twins的功能以及和Tau蛋白的交互作用(2010) 葉柏安; Po-An YehPR55Bbeta的表現異常，長久以來一直被認為是小腦萎縮12型的致病原因。隨後的研究指出，PR55Bbeta的表現量增加，極可能是小腦萎縮12型的致病原因。然而，可以模擬小腦萎縮12型的動物模式，一直沒被建立，以其在生物體內的致病機轉仍不明確。在本研究實驗中，PR55Bbeta過渡表現的果蠅模式被建立，而且其果蠅表現出運動力下降和神經病變的特徵。在研究PR55Bbeta和Tau蛋白之間的作用時，我意外的利用果蠅背甲上毛的數目，建立一個新穎的模式系統，可以穩定的檢測出Tau蛋白的磷酸化程度。研究期間，我更發現，磷酸化的Tau蛋白，有保護神經的功能，並且延長果蠅的壽命。相反的，無法磷酸的Tau蛋白，對神經的發育有不好的影響。最後，本研究也指出，PP2A的B次單元與細胞骨架的調控有關，為一個新發現的嶄新的功能。也許這些研究成果，可以連結小腦萎縮12型和阿茲海默症之間致病機轉的關連。Item 台灣人族群阿茲海默氏症及血管型失智症的生物標記評估(2009) 王秀觀; Hsiu-Kuan Wang阿茲海默症與血管型失智症是最普遍的兩類失智症。目前有關阿茲海默症的疾病診斷生物標記分子研究中，已知的遺傳標記分子有脂蛋白E基因4對偶基因、類澱粉蛋白前驅蛋白基因突變、早老素1及早老素2基因突變等。腦部及腦脊髓液中tau蛋白與類澱粉蛋白含量則為已確認的阿茲海默症疾病診斷蛋白標記分子。本研究利用台灣阿茲海默症、血管型失智症與正常人族群基因分型技術，分析候選基因多型性變異與疾病的相關性。結果發現脂蛋白E基因4對偶基因是阿茲海默症、而非血管型失智症的風險因子；血管收縮素轉換酶基因DD基因型、D對偶基因和-240 T – Alu D單套型是阿茲海默症與血管型失智症的風險因子；此外，實驗結果顯示介白素1基因-889 CT基因型對於70歲以上的血管型失智症罹病感受方面具有潛在的保護功能；同時，熱休克A5基因-415 AA/-180 GG基因型、-415 A/-180 G對偶基因會減低罹患阿茲海默症的風險。基因表現分析結果亦顯示，具有-415 A/-180 G對偶基因的細胞在遭受內質網壓力之後，其熱休克A5蛋白被誘發產生的程度明顯增加。由於尋找阿茲海默症淋巴細胞的生物標記的可行性，本論文亦分析了8個阿茲海默症及4個年齡、性別配合之正常人的APP蛋白型式及氧化蛋白，但未找到明顯的蛋白標記。以上實驗結果顯示，上述與阿茲海默症及/或血管型失智症的罹病相關的基因，可作為協助疾病診斷的遺傳標記分子。Item TBP 的功能缺失參與在Tauopathy 的致病機轉中(2012) 王湘瑜; Hsiang-Yu Wang前人的研究發現阿茲海默症患者腦中TATA box binding protein (TBP) 會與tau所形成的neurofibrillary tangles (NFTs) 共沉積在細胞質內，表示tauopathy 的致病機轉可能有一部份是透過影響TBP的正常功能而來。由於大部分基因的轉錄都需要TBP的參與，因此我們想知道轉錄缺失是否是tauopathy的致病原因之一，首先我們利用已建立表現正常人類tau蛋白的tauopathy模式果蠅進行藥物實驗，當 我們將tau蛋白表現在這些模式果蠅背甲上時，會造成其背甲剛毛數目的減少，但投以包括SAHA等的HDAC inhibitors藥物時，會降低tau蛋白過量表現所造成的背甲剛毛數量的減少，表示轉錄功能的缺失或許參與在tuaopathies的致病機轉中。我們的實驗結果發現在細胞模式下TBP會與NFTs共同沉積在細胞質內，且TBP促進轉錄的功能也會受到影響。為了在動物模式下也證明我們的實驗，我們創造了表現纖維化tau蛋白的模式果蠅，此種模式果蠅的壽命較野生型果蠅短 。同時我們也發現了這些轉基因果蠅內會表現不可溶的纖維化蛋白。為了證明TBP功能缺失也會發生在我們的模式果蠅中，我們發現 TBP在轉基因果蠅腦中也會與tau蛋白共沈積在一起，與之前的細胞模式實驗結果相同。我們的研究結果將會提供一個治療包括阿茲海默症以及其他tauopathy的契機，透過HDAC inhibitors 藥物的投與，促進基因轉錄以治療tau所造成的TBP功能缺失。