學位論文
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Item 基因剃除血栓烷A2合成酶和血栓烷前列腺素接受器訊息對腎缺血再灌流引起之氧化傷害效益(2020) 覺宗宏; Chueh, Tsung-Hung我的研究目的是利用剔除「血栓烷A2合成酶/血栓烷A2/血栓烷前列腺素受體」(TXAS / TXA2 / TP)的基因，來阻斷它的信號傳導，檢驗是否可以減少小鼠的腎臟缺血/再灌注的損傷。「血栓烷A2合成酶/血栓烷A2/血栓烷前列腺素受體」(TXAS / TXA2 / TP)的正常生理功能，可促進血管收縮，以及血小板凝集，幫助人體在受傷時止血。但在許多病理情況下，會造成「血栓烷A2合成酶/血栓烷A2/血栓烷前列腺素受體」(TXAS / TXA2 / TP)過度活化，誘發氧化傷害，例如，心肌梗塞，肺高壓，子癲前症，器官移植，狼瘡腎炎，敗血性休克，腎絲球腎炎，以及各類血栓疾病。在以上的病理情況下，血栓烷A2合成酶（TXAS）活性會增強，刺激血栓烷A2（TXA2）釋放和血栓烷前列腺素受體（TP）活化，造成嚴重的血管收縮和氧化損傷。因此，本研究利用基因剔除「血栓烷A2合成酶/血栓烷A2/血栓烷前列腺素受體」(TXAS / TXA2 / TP)的訊號傳遞，期待瞭解更多關於腎臟缺血/再灌注損傷的病理機轉，並希望能在這樣的基礎上研究出治療方法。中醫藥有數千年的傳承，其中，活血化瘀藥的使用，在中醫治療腎臟病中，扮演重要的角色，但其中的現代藥理機轉，仍有待進一步研究。活血化瘀的效果，類似現代生理的血管擴張與抗凝血作用，與TXA2的效果相反。因此，本研究希望這次的實驗結果，可以在未來作為研究中醫活血化瘀藥物治療腎臟病的研究模型，以期揭開中醫神秘的面紗，並找出中醫藥在現代疾病的應用。 本研究分別在以下四種基因型小鼠TXAS+/+TP+/+，TXAS–/–,TP–/–以及TXAS–/–TP–/–身上，評估了靜脈注射U46619（TXA2模擬物）和45分鐘腎缺血再灌注（I/R）所造成的的腎臟血流動力學變化和腎損傷。我檢驗了腎臟中TXAS和TP的基因表達狀況，血尿素氮（BUN）和肌酐酸，活性氧（ROS）的量，還有促炎性細胞因子和細胞死亡的病理生理機轉，包括I/R損傷下造成的的細胞凋亡，細胞自噬和細胞焦亡。 實驗結果發現，在野生型的小鼠(TXAS+/+TP+/+)身上，腎臟的缺血/再灌流(I/R)，增強了TXAS，TP的表現；也增強了發炎及氧化壓力相關的參數，包括細胞核中NF-κB，NADPH氧化酶gp91的表現；三種計畫性細胞死亡的參數，也有顯著增加，包括細胞凋亡(Bax / Bcl-2 / Caspase-3)，細胞自噬(Beclin-1 / LC3 II)，細胞焦亡Caspase-1 / gasdermin D / IL-1β)。而且，野生型小鼠中腎臟TXB2濃度，ROS含量，血中尿素氮，肌酐酸，在經過缺血/再灌流(I/R)之後，都有顯著上升。而能夠 擴張血管的eNOS在腎臟中的表達下降。 在另外三種基因剔除小鼠中(TXAS–/–,TP–/–以及TXAS–/–TP–/–)，所有的增強參數均顯著降低。在TXAS+/+TP+/+和TXAS–/–小鼠中，靜脈注射U46619顯著抑制了腎微循環並增強了gp91和Bax / Bcl-2；在TP–/–和TXAS–/–TP–/–，靜脈注射U46619，則沒有這種效果。腎臟的缺血再灌流，顯著降低了四組小鼠的腎臟微循環，但是跟野生型小鼠(TXAS+/+TP+/+)相比，TXAS–/–, TP–/– 和TXAS–/–TP–/–這三組小鼠，恢復至基準線腎血流量的時間顯著縮短。由以上可知，阻斷(TXAS / TXA2 / TP)信號傳導，可減弱I/R造成的促炎細胞因子增加。 由本研究的結果可知，透過基因剔除來阻斷TXAS / TXA2 / TP信號傳導，可透過抗氧化，抗發炎，抗凋亡，抗自噬和抗焦亡的作用，對於缺血/再灌流造成的腎損傷產生保護作用。TXAS / TXA2 / TP信號傳遞路徑，主要的正常生理作用為促進血小板凝結，跟促進血管收縮。中醫的活血化瘀藥，常用於治療腎臟病。而這些活血化瘀中藥的效果，類似現代藥理作用中，促進血流增加與抗凝血的作用，與TXA2的作用相反。因此，在未來，我們可以利用本研究的動物模型來測試，中醫活血化瘀藥物治療腎臟病的機轉，是否與抑制TXAS / TXA2 / TP信號傳遞路徑有關。Item 單側輸尿管阻塞誘發氧化壓力對大鼠腎小管細胞之凋亡與自噬表現之影響(2008) 賴亭諭; Lai Ting-Yu單側阻塞性尿路疾病是指尿液無法經由腎臟或輸尿管流入膀胱，尿液迴流造成腎水腫。其發生原因如單側輸尿管結石、狹窄、腫瘤、受傷等，但仍以腎結石最常見，而單側輸尿管阻塞則是一種適合模擬阻塞性尿路腎臟漸進式纖維化發展過程的病理模型。本研究主要在探討單側輸尿管阻塞造成腎臟損傷過中，活性氧、細胞凋亡與細胞自噬的角色以及細胞凋亡與細胞自噬的關係。本實驗利用大白屬於其右側輸尿管靠近腎臟三分之ㄧ處用兩條繩子分別打結，接著縫合腹腔。之後將老鼠隨機分成八組，第一組無進行結紮手術，其餘分別於術後4hr、8hr、12hr、1天、3天、5天、7天進行生理實驗並抽取500μl腎靜脈血進行自由基測定，另外動物犧牲後取阻塞腎臟，利用西方墨點法測定蛋白表現量；使用免疫組織染色觀察腎臟組織型態。結果發現腎靜脈血液H2O2/OH.-類的自由基於阻塞後四至十二小時期間有上升趨勢，而Catalase和MnSOD的蛋白表現從阻塞四小時開始就隨時間下降；腎臟組織Bax/Bcl-2比值及Caspase 3蛋白表現表現則增加；自噬作用的起始蛋白Beclin1及中期蛋白Atg5-Atg12和後期蛋白LC3表現則在阻塞3天後開始逐漸增加，從切片染色結果也發現自噬作用發生在腎臟近端與遠端腎小管處。我們的結果發現自噬作用蛋白和凋亡作用蛋白表現時間一致，表示自噬作用在單側輸尿管阻塞動物模式中有協同細胞死亡的功能。