學位論文
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Item 利用活細胞系統方式探討Bβ2過度表現對細胞影響(2010) 簡君宇; Jiun-Yu Jian目前的研究指出脊髓小腦運動失調症12型(Spinocerebellar ataxia type 12, SCA12) 可能是PPP2R2B基因的5’端未轉譯區域的CAG三核苷酸擴充所致。PPP2R2B基因轉譯出具有腦特異性之Bβ調控次單元，這個Bβ調控次單元為蛋白去磷酸酶2A(PP2A)的其中一單元。由於5’端未轉譯區的不正常擴增，可能使得基因PPP2R2B產生選擇性剪切(alternative splicing)，而轉譯出其中的一個Bβ調節次單元Bβ2。過去的文獻提出Bβ2-PP2A會有粒腺體專一性，使Bβ2-PP2A停留在粒腺體外膜造成類神經細胞株PC-12凋亡。在細胞模式上，我們利用脂質體攜帶Bβ2基因送入神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y，並處理視網酸(retinoic acid)使其分化為似神經的成熟細胞來進行觀察過量Bβ2表現是否位於粒腺體上，及Bβ2過度表現對細胞所造成的氧化壓力。在活細胞系統的長時間連續性觀察中，我們可以發現過度表現Bβ2的SH-SY5Y細胞有較對照組不正常的細胞型態。在了解到Bβ2在細胞中所參與的角色，期能在未來提供一個藥物篩選的平台。Item 環境壓力對人類神經細胞過度表現Protein Phosphatase 2A次單位PPP2R2B的影響(2009) 鄭琬婷; Cheng Wan-TingProtein phosphatase 2A (PP2A)是屬於serine/threonine去磷酸酶的一種，能調控細胞的生長、存活和凋亡。哺乳類動物中，Bβ次單位是PP2A在腦神經細胞中的專一表現的次表型。當Bβ基因有所損害或過度表現時，會造成神經細胞的病變。本論文分別將能專一表現於細胞質的Bβ1和專一表現於粒線體的Bβ2質體轉殖入神經腫瘤母細胞SK-N-SH中，建立穩定細胞株。利用H2O2和tert-butyl hydroperoxide (tBHP)作為氧化壓力來源，經48小時的處理後，Bβ2細胞株的存活率會急遽下降，由Annexin V和PI雙重染色的結果中證實是因細胞凋亡而降低存活率，但Bβ1細胞株則否。進一步轉殖LC3-EGFP質體和對酸性液泡胞器染色鑑定細胞自噬的發生，可以看出Bβ2細胞株本身便有些微細胞自噬體存在，當經氧化壓力後更引發Bβ2細胞株有更多細胞自噬體出現。但以細胞自噬抑制劑3-methyladenine (3-MA)對細胞作前處理24小時後，再經過氧化物處理，則各Bβ2細胞株的sub-G1期細胞比例皆會下降，而酸性液泡胞器的密度也明顯降低。證明氧化壓力所引起的細胞凋亡是經由細胞自噬路徑而產生。另利用降低培養液中的血清濃度模擬營養缺乏的情況，當無血清培養48小時的Bβ1細胞株之sub-G1期細胞比例較Bβ2細胞株高出許多，當血清濃度降低時，Bβ1細胞株的酸性液泡胞器也較Bβ2細胞株的密度高，證實營養缺乏在Bβ1細胞株所引發的細胞凋亡是經由細胞自噬。本論文針對過度表現PPP2R2B的細胞株分別於氧化壓力和營養缺乏的壓力下，細胞所產生的生理變化，模擬神經退化病變的產生，並瞭解病變機制，祈能對神經退化疾病的研究與治療有所助益。Item 建立和分析過量表現PPP2R2B基因之基因轉殖小鼠(2006) 林立昉; Li Fang LinSpinocerebellar ataxia 12 (SCA12)，它是一種自體顯性遺傳疾病，根據文獻報告，SCA12是在已知基因PPP2R2B基因5’端CAG擴增所造成,也是目前在各型SCA疾病中所僅知功能基因5’端未轉錄部分作擴增造成之結果，PPP2R2B基因會轉譯出一個專一表現在腦部的去磷酸PP2A (protein phosphotase 2A)的調控次單位Bβ，而CAG的擴增也被認為可能會影響到去磷酸酶的活性。我們分別建立由神經專一性表現之NSE 啟動子過量表現PPP2R2B之細胞株和基因轉殖小鼠。在Bβ表現之細胞株，我們發現Bβ調控次單位會使細胞在無血清之情況下之增生能力下降，因此，我們認為Bβ可能使細胞對環境壓力有較大的敏感性。而在動物方面目前成功建立的十株基因轉殖小鼠，有八株可在小鼠的腦部觀察到明顯的綠螢光蛋白訊號，也偵測到基因轉殖小鼠line-20腦部有PPP2R2B轉殖基因之蛋白產物表現。在行為表現方面，比較同胎出生的野生型小鼠後我們發現，基因轉殖小鼠line-20在平衡桿測試(beam test)和滾輪(rota-rod)測試，明顯有較差的表現，進一步在病理學方面的分析也發現到line-20基因轉殖小鼠小腦的Purkinje數量較少， 我們初步的結論是過量表現PPP2R2B會造成基因轉殖小鼠之病變，其中之分子機轉則更需進一步的分析。Item 神經組織粒線體過度表現Bβ2之轉殖基因鼠的建立與神經病理分析(2008) 陳浚榕; Chun-Jung ChenPP2A主要包含三個次單元分別為A(結構次單元)，B(調控次單元)，C(催化單元)。 調控次單元影響PP2A在細胞內存在的位置及PP2A受質的特異性。根據一些研究報告指出，Bβ 調控次單元基因與脊髓小腦運動失調症12型(spinocerebellar ataxia type 12，SCA12)有所關聯。 Bβ有兩種異構物，Bβ1及Bβ2，SCA12是由於Bβ1啟動子區域CAG三核苷酸擴充所致，目前尚未確定這個不被轉錄的三核苷酸擴充是影響Bβ1轉錄活性或涉及到Bβ1/Bβ2啟動子間使用頻率。在之前報導指出在PC12細胞中Bβ2-PP2A會進入粒線體中，並且促使該細胞進入細胞凋亡。 為了在動物模式中測試這個假設，我們建立神經組織粒線體過度表現Bβ2之轉殖基因小鼠。我們觀察到轉殖鼠有幾個異常的性狀，包含了體型小，毛髮稀疏，脊椎彎曲以及早期夭折等。 我們也利用量化的運動行為分析以及病理分析以了解這些基因轉殖鼠於粒線體中過度表現Bβ2之影響， 期許透過此結果能了解Bβ2於粒線體表現與SCA12之關聯。目前之研究結果顯示，因Bβ2於粒線體之表現的確提升了不同腦區PP2A之活性，也同時造成cytochrome c之釋出，MnSOD氧化壓力指標及Caspase 3細胞自戕分子之上升，而這些傷害進一步也的確讓我們看到小鼠在Rotarod及HomeCageScan行為上的異常，由這些結果看來，Bβ2於粒線體之表現的確造成神經退化。Item PPP2R2B過度表現對人類神經細胞骨架蛋白的影響(2008) 郭至軒; Zhi-Xuan Guo蛋白質去磷酸酶2A型(PP2A)是一種由三種單體組成的酵素，它包含了一個催化單元(C)、一個結構單元(A)、以及一個可變的調節性單元(B)。這個可變的B單元(B, B',與B''家族)支配著PP2A的受質特異性及其在細胞內的表現位置，PP2A在細胞許多方面的功能都扮演了重要的角色。ppp2r2b是負責轉錄Bbeta可變單元的基因，Bbeta1與Bbeta2則是選擇性拼接下所轉譯出的兩種產物，它們具有不同的N端。第十二型脊髓小腦萎縮症 (SCA12)與ppp2r2b的5'-UTR產生過度擴增CAG三核苷酸有關。本研究目的是將胞器專一性的細胞質Bbeta1與粒線體Bbeta2等次單元，分別轉殖入神經纖維母細胞SK-N-SH，次將細胞經篩選之後，建立起永久表現的細胞株，維持其細胞生長，並使用西方墨漬法、共軛焦顯微鏡、PP2A酵素活性分析等方式深入探討這些轉殖細胞。轉殖細胞株皆分別過度表現Bbeta1與Bbeta2，其中Bbeta2的PP2A活性有顯著提昇，此外轉殖的Bbeta2共存於粒線體，Bbeta1則存在細胞質。Bbeta1與Bbeta2過度表現會造成tau過度表現與磷酸化，此現象與PI3-kinase/Akt/GSK-3beta pathway的活化相關，Bbeta1與Bbeta2過度表現也會破壞F-actin的完整性，影響adherens junction的分佈，而且 autophagosome生成也會增加。此外Bbeta2過度表現會促進神經分化，並且提昇Bcl-2表現。本研究證實所建立的神經退化性細胞模式，可做神經退化性疾病的發生及治療的參考。