學位論文
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Item 探討新生期dexamethasone處理對大鼠海馬迴中動情素受體之表現量及長期增益效應之影響(2021) 仉鵬愷; Chang, Peng-Kai地塞米松（dexamethasone, DEX）是一種人工合成的糖皮質固醇（synthetic glucocorticoids），數十年來被廣泛用作抗發炎藥物 （anti-inflammatory drugs）。同時也用來治療及預防出生體重過低 （extreme low birth weight, ELBW）早產兒的慢性肺部疾病 （chronic respiratory disease）。許多研究指出，新生兒時期的地塞米松治療 （neonatal dexamethasone treatment, NDT）可能對早產兒的情緒 （emotional）和認知 （cognitive）功能產生長期不良的作用。我們先前的研究指出NDT於雄鼠與雌鼠身上，均會造成長期的不良影響，包含類憂鬱行為（depression-like behavior）的增加，以及雌性大鼠海馬迴 （hippocampus）中α型雌激素受體 （estrogen receptor alpha, ERα）和G蛋白雌激素受體 （G-protein coupled estrogen receptor, GPER so-called GPR30）的表現量下降，且可能為NDT對雌鼠造成長期不良影響的重要原因。我們本研究中驗證是哪一種雌激素受體，為造成NDT青少年雌鼠長期不良反應的主因。本實驗中使用新生的Wistar大鼠，從出生後第一天到第三天 （postnatal day 1~3, PND 1-3），給予劑量遞減式 （tapering）的DEX皮下注射，自PND 1-3其劑量依序為0.5、0.3和0.1 mg/kg。 於六周齡時，利用開放空間試驗（open field test, OFT）評估NDT大鼠自發性運動功能（spontaneous activity），另外透過強迫游泳試驗 （forced swimming test, FST），評測NDT大鼠的類憂鬱行為。 此外，準備平行組（parallel group）的NDT大鼠，於相同周齡時進行即時聚合酶鏈鎖反應 （real-time polymerase chain reaction, qPCR）評估海馬迴中Erα, Erβ, Gper, Grin1, Grin2a, Grin2b等基因表現。並利用西方墨點法（western blotting）評估mitogen activated protein kinase （MAPK） 的蛋白質表現量及其磷酸化水平（phosphorylation level）。 亦進行了離體胞外電生理記錄 （in vitro extracellular recording），測量海馬迴以高頻刺激誘導的長期增益作用（high frequency stimulation-induced long-term potentiation, HFS-LTP），以評估其海馬迴的神經可塑性（neuroplasticity）。最後利用強迫游泳試驗，以評估投予ERα致效劑（agonist），是否對NDT大鼠具有抗憂鬱（anti-depressant）的功能。實驗結果顯示，NDT動物青春期前的體重顯著降低，這證明DEX的有效投藥。 OFT的結果顯示NDT動物的自發運動功能未受影響。FST的結果顯示NDT會導致類憂鬱行為的增加。雌性青少年大鼠NDT組的不掙扎的時間（immobility）與對照組相比有顯著增加。而雄性青少年NDT大鼠，則必須先給予高台曝露（platform exposure）之急性壓力處理後，其不掙扎的時間才有顯著增加。qPCR結果顯示，雌性青少年NDT大鼠海馬迴中Erα的表現顯著降低，而Erβ 和 Gper表現量則無明顯差異。NDT雄性青少年大鼠海馬迴中Erα, Erβ 及 Gper的表現量，與控制組間相較，皆無呈現顯著差異。雌性青少年NDT大鼠海馬迴中Grin1, Grin2a 及 Grin2b表現量皆沒有呈現差異。電生理實驗結果顯示NDT母鼠的海馬迴HFS-LTP有顯著下降的現象，而輸入和輸出曲線比值（input/output curve ratio, I/O curve）結果顯示，NDT老鼠與對照組相比有顯著下降的現象。而在配對脈衝促進 (pair-pulse facilitation, PPF) 實驗結果中並無呈現顯著差異。透過表面灌流 (suprafusion) ERα致效劑丙吡唑三醇 （propyl pyrazole triol, PPT）後，NDT雌性大鼠的海馬迴HFS-LTP恢復至正常範圍。而預先投予ERα的拮抗劑methyl-piperidino-pyrazole （MPP），可以阻擋PPT對HFS-LTP的恢復效果；而NDT組經皮下注射PPT後，其不掙扎的時間明顯減少，與對照組相比無顯著差異，顯示其具有降低類憂鬱行為的效果。最後我們利用GPER的致效劑同時為ERα和ERβ的抑制劑氟維司群（fulvestrant）進行驗證，投予fulvestrant無法使NDT雌性大鼠的海馬迴HFS-LTP恢復至正常範圍。 西方墨點法結果顯示，NDT並未影響雌性青少年大鼠海馬迴中MAPK 的蛋白質表現量及磷酸化水平。綜合上述實驗結果，我們推論NDT青少年雌性大鼠的不良反應，較可能是藉由影響ERα的表現而造成。實驗結果可供後續臨床研究參考，例如投予PPT治療NDT所造成的長期不良反應。Item 探討青少年期捆綁處理對海馬迴功能之長期不良影響(2020) 董佑萱; Tung, Yu-Hsuen青春期遭遇性騷擾(sexual harassment)、學校霸凌(bullying)、情感虐待(psychological abuse)和家庭暴力(domestic violence)等創傷經驗會導致心理創傷(psychological trauma)，已被證實會對心理健康產生長期的不良影響，並增加成年後罹患精神疾病的風險。不幸的是，針對其不良影響的發生，目前僅有少數研究與有限的治療策略。本研究之主要目的為利用青春期綑綁處理動物模式(juvenile immobilization treatment, J_IMO)模擬青少年期創傷經驗，以探究其對海馬迥功能(hippocampal function)的不良影響及其神經機。 本研究採用C57BL / 6J品系雄性小鼠，在出生後第35天和第36天(postnatal day, PND)時進行每天一次2小時，共兩天的J_IMO處理。於第二次綑綁處理後一週時(PND-42)分別進行行為(behavioral)、電生理(electrophysiological)和生化(biochemical)實驗。行為實驗採用抑制迴避測試(inhibitory avoidance, IA) 來評估海馬迴(hippocampus)的學習記憶功能，IA為一與海馬迥功能高度相關的記憶試驗。我們也利用開放空間測試(open field test, OFT)和高架十字迷宮測試(elevated plus-maze test , EPM)來評估J_IMO的類焦慮行為(anxiety-like behavior)。部分動物則斷頭犧牲取腦，製成海馬迴腦切片用於離體胞外電生理記錄(in vitro extracellular recording)，以高頻電刺激(high-frequency stimulation, HFS)誘發的長期增益效應(long-term potentiation, LTP)，來評估動物海馬迴的神經可塑性(neuroplasticity)。為了防止行為實驗對生化分析所造成之干擾，我們以相同的方式準備了另外一批動物，於PND-42時斷頭犧牲，取出其海馬迴進行即時定量聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction, qPCR)分析Grin2a （NR2A受體），Slc12a2 （鈉鉀氯共轉運蛋白2，又簡稱NKCC1），Slc12a5 (鈉鉀氯共轉運蛋白5，又簡稱KCC2), Gabra1（GABAA受體）和Fkbp5（co-chaperone with the heat shock protein 90 and steroid complex）等基因的表現，並且利用西方墨點法（Western blot）來確認NKCC1的蛋白質表現量。 實驗結果顯示，經 J_IMO處理的小鼠，其抑制性迴避學習增強，合併出現削減學習(extinction learning)減弱的現象。而OFT的結果顯示J_IMO組的類焦慮行為有增加的情形，然而在EPM中並未獲得一致的結果。J_IMO組動物的海馬迴HFS-LTP有增強的現象，與對照組相較經J_IMO處理小鼠的輸入和輸出曲線比值（input/output curve ratio, I/O curve）中出現顯著增加的現象。而在配對脈衝促進（pair-pulse facilitation. PPF）的結果並無顯著差異。這些結果暗示海馬迴HFS-LTP的增強應是源自突觸後的機制(post-synaptic mechanism)，例如受體表現量增加(up-regulation)，或者信號傳遞活性增強。qPCR的結果顯示，經J_IMO處理小鼠海馬迴中Grin2a和Slc12a2的表現量顯著增加，可以證明J_IMO組海馬迴突觸後的機制改變。Fkbp5，Slc12a5和Gabra1的表現量未呈顯著差異。之後，我們以表面灌流(suprafusion)方式投予兩種環形利尿劑(loop diuretics)，呋塞米(furosemide)或布美他尼(bumetanide)為NKCC1抑制劑，可將海馬迴HSF-LTP恢復至正常範圍。綜合各項實驗結果，經過J_IMO處理的小鼠表現出異常的行為表現，包括迴避學習之增強、消減學習(extinction learning)能力減弱，和類焦慮行為的增加。J_IMO組的海馬迴HSF-LTP增強海，馬迴功能相關基因如Grin2a，Slc12a2的表現量明顯改變。這些結果共同顯示出，給予J_IMO急性處理也可能對海馬迴功能產生長期影響。 本研究結論為J_IMO處理成功地模擬了青少年的創傷經歷，並且產生長期的不良影響，這和前人之成年IMO處理的研究發現是一致的。有趣的是，我們發現NKCC1在J_IMO小鼠中的海馬迴表現量發生了變化，這解釋J_IMO治療處理不良反應的可能機制。我們建議NKCC1抑制劑如布美他尼可以作為治療藥物，以減輕青少年創傷事件引起的行為異常。Item 台灣三種蝙蝠之出生後神經元新生(2014) 謝佳瞜; Carol Seah在哺乳類動物大腦中終其一生都會有神經元新生。出生後的神經元新生發生在大腦的兩個區域，一為嗅球（OB）和另一為海馬迴的齒狀迴（DG）。位於側腦室旁的神經幹細胞會產生嗅球的神經元，而和齒狀迴內側的神經幹細胞則會產生齒狀迴神經元。新生的神經元要建立突觸連接，融入原有的神經迴路才會存活下來並且發揮它的功能。到目前為止，大部分出生後神經元新生的研究都集中在實驗室飼養的囓齒類動物，至於在野生動物大腦裡的出生後神經元新生並未完全闡明。蝙蝠是唯一會飛行且比囓齒類動物較為長壽的哺乳類動物。除此之外，蝙蝠是靠回聲定位系統辨別方向、辨認障礙物的大小材質以及捕抓獵物等。由於蝙蝠有特殊的空間辨識能力，加上台灣蝙蝠大腦內的出生後神經元新生到目前為止並沒有被研究過，因此本研究主要想探討台灣蝙蝠腦內的出生後神經元新生。我們使用胸苷類似物BrdU來標定新生的細胞和可以辨認與神經發育相關特定細胞群的抗體來研究台灣蝙蝠的出生後神經元新生的狀況。根據實驗結果，我們發現高頭蝠有與老鼠相似的嗅球神經元新生，但缺乏海馬迴神經元新生。而在摺翅蝠和葉鼻蝠則都有嗅球和海馬迴神經元新生。我們也使用了Sox2抗體標定在側腦室旁和齒狀迴內側的神經幹細胞。在這三種類的蝙蝠中都有神經幹細胞存在在這兩個腦區域。除此之外，我們也利用PSA-NCAM 和DCX抗體來標定神經母細胞。除了高頭蝠的齒狀迴之外，在側腦室旁和齒狀迴都可以偵測到神經母細胞的存在。另外，我們也使用了Ki67抗體標定在側腦室旁和齒狀迴正在細胞週期內的細胞。除了高頭蝠的齒狀迴以外，存在有神經幹細胞的腦區內都有發現正在進行細胞分裂的細胞。整體而言，蝙蝠的大腦神經元新生是一種種間特異的生理現象。