學位論文
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Item 甲基轉移酵素在肺癌病人變異的臨床研究及分子機制以及其作為新穎標靶抗癌藥物之探討(2007) 林若凱; Ruo-Kai Lin抑癌基因的啟動子位置上若被過度甲基化，導致該基因的不表達，往往造成腫瘤的生成。負責將啟動子甲基化的酵素是甲基轉移酵素(DNA 5’-cytosine-methyltransferase, DNMT)，包括有DNMT1、DNMT3a及DNMT3b；但其在肺癌病人或細胞模式中並未有完整之變異分子機制與臨床研究，且其在癌症病人及細胞常發生不正常活化的改變，故引發出在癌症的治療中將 DNMT 作為癌症治療標靶的想法。本研究在所檢測的100位非小細胞肺癌病人發現，其DNMT1、DNMT3a及DNMT3b mRNA及protein在腫瘤組織比正常肺組織有顯著過度表達的情形，P值分別有0.002、0.034 及0.027；特別是在鱗狀上皮細胞癌 (squamous carcinoma, SQ) 的病人統計發現DNMT1的蛋白有過度表達的情形，P值達0.04。當這些病人同時過度表達DNMT1及DNMT3b時，則顯示與p16INK4a、RARβ及FHIT 抑癌基因啟動子過度甲基化有關，P值達0.006。在病人的腫瘤組織採組織染色質免疫沉澱分析 (tissue chromatin immunoprecipitation) 的確發現DNMT1及DNMT3b蛋白是結合在過度甲基化的p16INK4a、RARβ及FHIT 基因啟動子上。 為了檢查DNMTs過度表達的原因，於是在肺癌細胞株H1299（不含p53基因）送入DNMTs的一個可能的負調控蛋白Wild-type p53，來了解p53對DNMTs啟動子的影響。本研究採用營火蟲冷光啟動子活性分析，發現Wild-type p53可抑制DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的啟動子活性，且在H1299肺癌細胞株長期表達Wild-type p53時，發現內生性的DNMTs之mRNA與蛋白表現量有下降的情形。而突變的p53蛋白則有增加其啟動子活性的趨勢。在病人組織樣本裡發現，這些有過度表達DNMT1的病人的確有p53 基因突變的情形，P值達0.016。這些病人同時以免疫組織染色來偵測DNMT1另一個可能的負調控蛋白RB，發現有過度表達DNMT1的病人同時伴隨著RB蛋白表達過低，P值達0.014。本研究進一步在正常的肺組織中利用組織染色質免疫沉澱分析，檢測到Wild-type p53及RB蛋白可以結合在DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的啟動子上。DNMTs除了受轉錄的調控之外，此研究更發現DNMT1的過度表達的病人與吸煙有顯著的相關，P值達0.037。在正常肺細胞IMR-90及肺癌細胞H1299測試下發現，DNMT1、3a及3b的蛋白質表現量可受香煙致癌物4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)的誘導而使其上升；此外，利用組織染色質免疫沉澱分析，發現在NNK處理細胞之後相較於控制組，檢測到DNMT1及DNMT3b蛋白結合在p16INK4a、RARβ及FHIT的啟動子上的程度顯著增加，該啟動子也的確被檢測是呈現過度甲基化。因此我們推測肺癌病人DNMTs的過度表達的原因可分為兩類：一是分子層次中的p53及RB變異有關，因其失去了負調控DNMT轉錄的能力；另一則是與吸煙有關，因香菸致癌物會誘導DNMTs的蛋白質表現量上升。而過度表達的DNMTs則使抑癌基因過度甲基化，最後導致肺癌的發生。 由於癌細胞基因體普遍出現CpG島群的甲基化異常而使抑癌基因失去活性的現象，因此抑制形成CpG島群的甲基化的藥物正可以作為恢復抑癌基因的表現及活化癌細胞中抑制癌症的重要路徑的新穎標靶藥物。而Mithramycin A (簡稱MMA)是一個會與富含GC及CG 序列的DNA 結合之藥物，因此本研究檢測癌細胞在經過MMA的處理之後，是否會抑制CpG島群甲基化的情形。我們發現當以低劑量(10 nM)的MMA處理癌細胞14天後，會減少轉移抑癌基因SLIT2及TIMP3的CpG島群過度甲基化的情形，並進而使這個具有抑制癌細胞轉移的SLIT2及TIMP3重現基因表達。同時間藉由膜穿透 (transwell) 實驗我們也發現MMA可降低具有高轉移能力的癌細胞CL1-5的穿越及移動能力。為了暸解MMA的作用途徑，我們使用西方點漬法發現MMA會使DNMT1蛋白明顯下降，但是DNMT1的基因表現不受影響。使用分子模擬 (molecular modeling) 發現DNMT的催化位置可被MMA藥劑所鍵結。總結研究結果發現，MMA具有去DNA甲基化及抑制癌細胞轉移的潛力。而抑制的機轉可能藉由抑制DNMT酵素催化能力並降低癌細胞中DNMT1的蛋白表達量，進而導致抑制癌細胞轉移的基因啟動子去甲基化且重新恢復表達。 本研究為首篇在肺癌病人或細胞模式針對三種主要甲基轉移酵素DNMT1, DNMT3a, DNMT3b完整之變異分子機制與臨床研究，且在肺癌細胞以GC DNA結合之MMA驗證其抑制 DNMT 作為癌症治療標靶的想法。Item 探討五種中藥單方處理非小細胞肺癌細胞株之效果(2011) 沈志謙; Chih-Chien, Shen替代性療法近來在許多疾病中因為療效良好而備受關注；其好處 為除了可以有效的治療疾病之外，相較之下，其所帶來的毒性或是副 作用可能低於傳統的治療方式。多年以來，肺癌即是許多國家癌症死 亡的首位，而本研究主要的目的就是想要探討傳統的中草藥配方是否 對於非小細胞肺癌細胞株A549, NCI-H460, NCI-H520 具有抑制其生 長或是存活的效果。我們對細胞分別用了五種不同的中草藥 (HC1-HC5)作處理，再探討這些藥物是透過甚麼樣的機制去減低細胞 生長的情形。我們發現在五種中草藥方內有兩種中草藥HC3以及HC4 對於減低非小細胞肺癌細胞株之存活率有顯著的影響，但相同的劑量 對於正常細胞株MRC5 則沒有太大的影響。另外我們也以流式細胞 儀以及西方墨點轉漬的實驗進一步的探討藥物處理對於細胞週期的 表現影響，我們發現在藥物處理後細胞族群較多停滯在G1 以及G2 的現象，分析調節細胞週期的蛋白質表現結果也符合流式細胞儀看到 的結果。除此之外，我們也發現了A549 側群細胞(具有類癌幹細胞的 特性)的比例在經過藥物處理後有顯著降低的趨勢，我們也分析了間 質-表皮轉換(MET)的相關蛋白以進一步的解釋癌幹細胞可能的變化 機制。另外我們也觀測到癌細胞的轉移能力因為藥物的處理而降低。 由我們的分析結果顯示這些藥物也許有潛力可以應用於肺癌治療。Item 以A549肺癌細胞株為模式篩選對非小細胞肺癌有治療潛力之中藥複方(2010) 王天駿; Tien-Chun Wang肺癌長期以來都是全世界致死率最高的癌症疾病。根據型態上和病理上的特徵分類之結果，絕大多數的肺癌病例屬於非小細胞肺癌。雖然現今已經發展出許多針對癌症的治療方法，卻依然沒有可以確實治癒癌症的方法。我們利用非小細胞肺癌細胞株A549為模式，篩檢十五種臨床上常用的中藥複方，期能找出能有效治療肺癌的替代性藥物。在細胞毒性的初步篩檢中，我們挑出三種可以有效抑制A549細胞生長卻不影響正常肺部組織細胞MRC5的中藥複方，分別是三號、五號及十四號藥方。在進一步的分析中發現，此三種複方的處理會造成A549細胞週期停滯進而抑制細胞的生長，但不會顯著地造成細胞死亡，同時我們也發現在經由三種複方的處理後，cyclin D3、cyclin B1、CDK4和CDK6這些細胞週期調控蛋白的表現，有顯著下降的現象，得到與細胞週期停滯現象一致之結果。此外，我們也發現三號及五號複方能有效地減少具有癌幹細胞特性的側群細胞(side population)的比率，而這個現象似乎與間葉表皮轉換(Mesenchymal to epithelial transition)的機制無關。我們也試著藉由檢測血管內皮新生因子A (VEGF-A)表現量去應證這些在中醫理論中具有活血化瘀效用的藥方是否對於癌症細胞分泌促血管增生因子的行為有調節的效用。本實驗的結果提供了分子生物學上的證據去解釋這些複方在臨床上可能的治病機轉以及中醫理論在分子生物學上的意義，更重要的是，我們發現三個中藥複方具有可以被用來抑制非小細胞肺癌細胞之潛力。