學位論文
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Item 應用單分子技術於SARS冠狀病毒核殼鞘蛋白-DNA交互作用之研究(2011) 許又仁; You-Ren HsuSARS-CoV核殼鞘蛋白(nucleocapsid protein)與其病毒RNA結合形成核殼體(ribonucleocapsid)是包裹形成病毒顆粒必要的過程。近來SARS-CoV核殼鞘蛋白的研究顯示其蛋白質的結構靠近N端與C端個別有一個具有結構的區塊(NTD與CTD)，且兩者皆能與RNA與DNA結合。在這個過程涵蓋了複雜的蛋白質-核酸交互作用，以及蛋白質之間彼此的交互作用。在傳統的生物化學技術如Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)應用於研究蛋白質-核酸交互作用有其技術性的限制，難以直接性的區別CTD與NTD與核酸結合過程中所扮演的腳色的差異。 這篇論文的目標是應用單分子技術構建一個可直接觀察SARS-CoV CTD與NTD個別與單一核酸分子產生交互作用過程的實驗系統。我們透過螢光染劑YOYO-1和DNA結合並接著在經聚乙二醇(PEG)改質的玻璃上，並透過Alexa594和蛋白質結合，構築螢光影像。使得實驗過程可透過兩種螢光的受激發後放光的波長不同，在不同的濾鏡頻道下分別觀察DNA與蛋白質產生交互作用時的影像。 實驗的結果意外的發現SARS-CoV CTD在低濃度的環境下，SARS-CoV CTD會產生聚合(Aggregation)的現象，使得少量SARS-CoV CTD以Oligomer形式存在；而SARS-CoV NTD在相同的濃度條件卻並不產生聚合的現象。而在蛋白質與核酸交互作用的實驗當中，我們觀測到SARS-CoV CTD與DNA之間的親和力(affinity)大於SARS-CoV NTD與DNA之間的親和力與相關文獻的EMSA結果一致。透過此實驗系統的建構，可進一步應用於了解核殼鞘蛋白(NP)-RNA交互作用與SARS-CoV RNA的包裹機制。