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Examination of effects of GSK3β phosphorylation, β-catenin phosphorylation, and β-catenin degradation on kinetics of Wnt signaling pathway using computational method
(2009-07-22) Sun, Ying-Chieh
Abstract Background Recent experiments have explored effects of activities of kinases other than the well-studied GSK3β, in wnt pathway signaling, particularly at the level of β-catenin. It has also been found that the kinase PKA attenuates β-catenin degradation. However, the effects of these kinases on the level and degradation of β-catenin and the resulting downstream transcription activity remain to be clarified. Furthermore, the effect of GSK3β phosphorylation on the β-catenin level has not been examined computationally. In the present study, the effects of phosphorylation of GSK3β and of phosphorylations and degradation of β-catenin on the kinetics of the wnt signaling pathway were examined computationally. Methods The well-known computational Lee-Heinrich kinetic model of the wnt pathway was modified to include these effects. The rate laws of reactions in the modified model were solved numerically to examine these effects on β-catenin level. Results The computations showed that the β-catenin level is almost linearly proportional to the phosphorylation activity of GSK3β. The dependence of β-catenin level on the phosphorylation and degradation of free β-catenin and downstream TCF activity can be analyzed with an approximate, simple function of kinetic parameters for added reaction steps associated with effects examined, rationalizing the experimental results. Conclusion The phosphorylations of β-catenin by kinases other than GSK3β involve free unphorphorylated β-catenin rather than GSK3β-phosphorylated β-catenin*. In order to account for the observed enhancement of TCF activity, the β-catenin dephosphorylation step is essential, and the kinetic parameters of β-catenin phosphorylation and degradation need to meet a condition described in the main text. These findings should be useful for future experiments.
以熱力學積分分子動力學模擬計算吡唑噠嗪化合物與GSK-3β激酶的相對結合自由能
(2015) 許文綺; Hsu, Wen-Chi
肝醣合成酶激酶 3 (glycogen synthase kinase 3, GSK-3)，是一種絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶，在阿茲海默症 (AD) 的發病機制上扮演著重要的角色。根據推測，當GSK-3β活性太高會導致tau 蛋白過度磷酸化因而產生AD症狀，如果能設計有效的抑制劑分子去抑制GSK-3β的活性，則可能達到減輕或治療AD疾病的效果。因此，我們使用熱力學積分ΔΔG的模擬方法去計算蛋白質與小分子間的相對結合自由能，藉此幫助我們去設計小分子抑制劑。首先，我們先計算已知實驗值的分子的結合親和力，所計算結果與實驗值有不錯的吻合。之後，我們利用相同計算程序去預測類似物分子的結合力，並且將這些分子推薦去做酵素實驗。我們總共計算了11個分子的相對自由能ΔΔG (kcal/mol)。有三個類似物分子 PP1、PP2和LL4 在酵素實驗上發現到有效的抑制能力。此外，我們對這三個類似物分別去探討不同的結合位向的關係。在不同結合位向計算上，我們發現計算LL4是以和ZRM相同的結合位向結合蛋白質；而PP1和PP2則是以不相同結合位向結合蛋白質。PP1、PP2和LL4的ΔΔG計算結果分別為5.1, 2.7和1.2 kcal/mol，實驗結果分別為3.7, 0.7和-0.4 kcal/mol，計算值和實驗值有一定的相關性，相關係數為0.83，在考慮不同位向計算上，docking結合TI方法的計算可以更準確預測到實驗結果。此外，在探討小分子與蛋白質的結合親和力關係上，我們建議在指向水的分子結構位置上加上親水性的官能基團，預測可能有效增進蛋白質與小分子間的結合親力。最後，我們希望本篇模擬結果提供的資訊，能在未來上更進一步幫助GSK-3β去設計有效的小分子抑制劑。
利用熱力學積分分子動力學模擬計算GSK-3β 激酶與配體複合體之相對結合自由能：含嘧啶環的化合物
(2015) 劉安倫; Liu, An-Lun
在阿茲海默症可能的發病機制探討中，人體腦部神經元中GSK-3β激酶蛋白過度磷酸化下游的tau蛋白被認為是其中一種主要的原因。透過抑制GSK-3β激酶可能減緩阿茲海默症症狀，甚至能達到治療成效。由於小分子與蛋白複合體間的結合自由能是反映抑制強度的重要物理量，本研究中使用熱力學積分分子動力學模擬輔助設計GSK-3β的競爭性抑制劑。此方法是利用參考分子與待測分子分別對目標蛋白的結合情況，去預測相對結合自由能(ΔΔG)。我們首先計算已知結晶構型及結合親和力的抑制劑。計算的結果與實驗值相差0.4 kcal/mol，顯示結果與實驗值吻合。接著我們利用同樣的計算流程預測自資料庫挑出的9個分子與已知結晶構型的參考分子ZRM之ΔΔG值。一開始本研究先假定分子的結合模式與ZRM相同，在這9個分子的計算結果當中，計算值均落在1.4-5.0 kcal/mol，是值得進行實驗測試的化合物。此外，本研究也探討了利用分子嵌合計算與這些結合構型的ΔΔG值，結果顯示9個分子有8個以原先類似ZRM的結合模式相同。這些預測小分子與蛋白之結合親和力與結合模式的結果將能輔助類似物分子抑制劑的設計。
小分子與蛋白質結合複合體之電腦模擬計算研究
(2017) 李德傑; Lee, Der-Jei
本研究中，我們使用了電腦模擬技術研究有潛力發展出藥物的蛋白質-小分子複合體，特別專注於研究競爭型的小分子抑制劑。熱力學積分及分子嵌合計算是本論文所使用的兩個主要計算方法，我們利用這兩個計算方法研究了三個蛋白質系統，介紹如下: 肝醣合成酶激酶-3(GSK-3) 我們藉由熱力學積分及分子嵌合去研究新型態的GSK-3β 抑制劑。首先從小分子資料庫中收集數百萬個化合物並進行嵌合計算篩選化合物，並選擇5個高評分的分子進行熱力學積分的計算，估計其結合強度及預測其結合位向，計算所得結合強度較強的分子將建議給實驗學家進行酵素實驗。在計算的5個分子中，預測了1個化合物的Kd值接近M，預測的結合位向結果可進一步運用於類似物抑制劑的開發上。半乳糖苷酶(Galactosidase) 我們藉由嵌合計算去計算幾種已知抑制劑並協助設計產生更好的衍生物。首先，先預測了已知抑制劑的結合位向，藉由疊圖與氫鍵分析分析半乳糖苷酶在活性位置的作用情形。之後，進一步地設計了13個相關的衍生物分子，並推薦了1個分子給實驗學家做酵素實驗。吲哚胺-吡咯2，3-雙加氧酶(IDO) 我們使用了共價嵌合計算去輔助設計具有共價鍵的抑制劑。總共彙整了3類抑制劑分子共38種化合物並使用共價嵌合計算來進行排序，這些化合物的排序有助於開發類似的共價抑制劑。關鍵字: GSK-3β 蛋白質激酶、IDO、半乳糖苷酶、分子嵌合、豐富指數、虛擬篩選、分子資料庫
肝醣合成酶激酶-3α, 3β 抑制劑分子搜尋:分子嵌合計算與激酶實驗
(2015) 許嘉仁; Hsu, Chia-Jen
阿茲海默症，又名老人失智症，為現今最嚴重的疾病其中之一。到目前為止，仍無法明確的得知發病原因。儘管如此，在罹患阿茲海默症患者的大腦中，卻有兩個顯著的病理特徵，為澱粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)的聚集以及神經纖維糾結(Neurofibrillary tangles, 簡稱NFTs)，科學家們指出，若能夠減輕或抑制這兩個病癥的生成，也許能夠減輕阿茲海默症的病情，甚至於治癒阿茲海默症。因此在本研究當中，我們的目標是利用幾個生物化學的研究工具(分子嵌合、分子動力學模擬等等)來找出具有潛力成為小分子藥物的候選化合物，來減低NTFs的生成。根據研究指出，NFTs的生成主要是因為Tau蛋白的過度磷酸化。目前已知GSK3α與GSK3β激酶磷酸化Tau蛋白，後者對於Tau 蛋白的過度磷酸化問題已廣被人研究，而GSK3α對Tau蛋白過度磷酸化的課題，在近期才逐漸被重視，一些研究顯示GSK3α的影響比GSK3β來的明顯。在本研究當中，我們利用酵素激酶實驗與分子嵌合軟體，來找尋新的且有潛力的小分子GSK3抑制劑，由於GSK3α 尚未廣泛被研究，因此我們將目標先放至GSK3β 上。在GSK3β的酵素激酶實驗上，我們測試了一些有潛力的化合物，這些化合物是由畢業的學姊於其論文中所推薦。在那些化合物當中，我們針對8個化合物進行了IC50曲線的測試，其中有四個化合物有明確的測出IC50值，其餘四個則是在高濃度的抑制率仍低於50%，因此無法得知IC50值。在已知的IC50值的化合物當中，以化合物編號VBNTNU063測出來的值最佳，其值為61nM；其餘三個標號為VBNTNU062, VBNTNU074和 VBNTNU075測出來的IC50值依序為64 uM, 65 uM, 和4.0x10-1 uM.。這些都被認為是好的藥物設計的先導化合物，其中T6已經推薦給細胞學家與動物學家來進行更進一步的測試。除了GSK3β的潛力抑制劑之外，我們對於找尋GSK3α的潛力抑制劑也有濃厚的興趣。由於GSK3α至今仍未有結晶構型，因此我們藉由同源模擬(Homology modeling) 與分子動態模擬(Molecular dynamics)來產生GSK3α之構型，以進行分子嵌合虛擬篩選計算，大量篩選(virtual screening)的計算程序是根據先前對GSk3β激酶研究的結果：Chemscore 的評分函數加上兩條氫鍵的設定。目前已經篩選了約150萬個小分子化合物，並推薦有潛力的GSK3α 抑制劑，於之後進行酵素激酶的實驗。